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Ceolotto, Giulio (2012) Ruolo di SIRT1 nella regolazione di e-selectine nella sindrome metabolica. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Background. Endothelial dysfunction and inflammation play a pathophysi-ological role in the development of metabolic syndrome (MetS) and its cardiovas-cular complications. Recent studies have shown that activation of sirtuin 1 (SIRT1), is reduced in mononuclear cells (PBMC) of patients with MetS, but the causes of this alteration is still undefined. Sirtuins are a family of seven enzymes (SIRT1-7) that are activated by caloric restriction and provide resistance to stress, reduced apoptosis and regulate the cell cycle. The purpose of this study was there-fore a) to study the relationship between expression of SIRT1 and markers of endo-thelial dysfunction (ICAM, VCAM, E-selectin) and inflammation (TNF- α) in pa-tients with MetS; b) to verify, in endothelial cells (HUVECs), the role of SIRT1 in the regulation of E-selectin release induced by TNF-α.
Patients and Methods. We studied 85 healthy volunteers (age 47 ± 0.9, F 64 and F 21), of which 21 met the criteria for MetS according to ATPIII. Gene ex-pression of SIRT1 was determined in mononuclear cells (PBMC) by quantitative real-time PCR analysis and Western Blot. The plasma concentration of ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin were analyzed on the Luminex platform (Bio-Plex sys-tem) using the Millipore kit 3-plex Human Panel-1 cardiovascular disease. In vitro, HUVECs were treated with TNF-α (0.1 µg/ml) to measure E-selectin release (Elisa kit), SIRT1 and nuclear factor-kB (NF-kB) expression and NF-kB activation (Im-munoprecipitation and Western Blot). SIRT1 silencing was determined by siRNA for SIRT1. Chromatin immunoprecipitation was performed to determine the bind-ing of NF-kB to the E-selectin promoter after TNF-α stimulation.
Results. Gene and protein expression of SIRT1 were significantly reduced in PBMCs of patients with MetS than non-MetS. The plasma concentration of E-selectin and TNF-α were significantly increased in subjects with MS than non-MS, while ICAM-1 and VCAM-1 were not different in the two groups of subjects. The plasma levels of E-selectin were positively correlated with blood pressure, waist circumference, triglycerides, blood glucose and insulin. SIRT1 gene expression was negatively correlated with plasma E-selectin. In HUVECs, TNF-α induced a maximal release of E-selectin after 24h, increased the level and the activation (ace-tylation) of p65 subunit of NF-kB. These effects were abolished by the presence of resveratrol, an activator of SIRT1, but not by sirtinol, an inhibitor of SIRT1, or in SIRT1-siRNA silencing cells. Finally, chromatin immunoprecipitation analysis demonstrated the binding of p65 subunit of NF-kB to the E-selectin promoter in-duced by TNF-α which was inhibited by resveratrol.
Conclusion The metabolic abnormalities seen in patients with MetS are as-sociated with increased plasma concentrations of E-selectin and a reduction of ex-pression of SIRT1.In HUVECs, the activation of SIRT1 by resveratrol decreases the release of E-selectin by attenuating the activation of NF-kB and the interaction with E-selectin promoter. Therefore, these results suggest a link between endothe-lial dysfunction and the regulation of SIRT1 which plays an important role in MetS.

Abstract (italiano)

Background. La disfunzione endoteliale e l’infiammazione svolgono un ruolo fisiopatologico fondamentale nello sviluppo della sindrome metabolica (MetS) e delle sue complicanze cardiovascolari. Recenti studi hanno dimostrato che l’espressione della proteina sirtuina 1 (SIRT1), enzima ad attività deacetilasica NAD+-dipendente, è ridotta nei linfomonociti (PBMC) di soggetti affetti da MetS, ma le cause di questa alterazione non sono ancora definite. Le sirtuine sono una famiglia di 7 enzimi (SIRT1-7) che vengono attivati dalla restrizione calorica e danno resistenza allo stress, riducono l’apoptosi e regolano il ciclo cellulare. Scopo dello studio è stato, pertanto, studiare, a) in vivo, la relazione tra l’espressione ge-nica di SIRT1e i markers di disfunzione endoteliale (ICAM, VCAM, E-selectine) e di infiammazione (TNF- α) in soggetti con SM e, b) in vitro, nelle cellule endote-liali (HUVECs) il ruolo di SIRT1 nella regolazione del rilascio di E-selectine sti-molato da TNF- α.
Metodi. In vivo, sono stati studiati 85 soggetti volontari sani (età 47± 0.9, M 64 e F 21), di cui 21 soddisfacevano i criteri di SM secondo l’ATPIII. Il plasma e linfomonociti sono stati ottenuti da ciascun soggetto per la determinazione della espressione genica di SIRT1 (PCR real time) e delle molecole di adesione e di in-fiammazione. La concentrazione plasmatica e nel terreno di coltura di ICAM-1, VCAM-1, E-selectine e TNF-α sono state analizzate su piattaforma Luminex (Bio-Plex System). In vitro, le cellule endoteliali (HUVECs) sono state incubate con TNF-α (0.1 µg/ml) per determinare il rilascio di E-selectine, l’espressione di SIRT1 e del fattore nucleare-kB (NF-kB), e l’attivazione (acetilazione) di NF-kB. Il silenziamento del gene SIRT1 è stato determinato mediante trasfezione delle cel-lule con siRNA per SIRT1. L’immunoprecipitazione della cromatina è stata esegui-ta per misurare il legame tra il fattore trascrizionale NF-kB e il promotore per il gene di E-selectine dopo la stimolazione con TNF-α.
Risultati. L’espressione genica e proteica di SIRT1 sono risultate essere significativamente ridotte nei PBMC dei soggetti affetti da MetS rispetto a quelli non MetS. La concentrazione plasmatica di E-selectine e di TNF-α sono risultate essere significativamente aumentate nei soggetti con SM rispetto a quelli non MetS, mentre ICAM-1 e VCAM-1 non sono risultate differenti nei due gruppi di soggetti. I valori plasmatici di E-selectine si sono correlati positivamente con pres-sione arteriosa, circonferenza vita, trigliceridi, glicemia e con insulinemia. L’espressione genica di SIRT1 si è correlata negativamente con la concentrazione plasmatica di E-selectine. In vitro, l’incubazione con TNF-α ha aumentato il rila-scio di E-selectine e l’espressione e l’attivazione della subunità p65 di NF-kB. Questi effetti sono stati inibiti dalla presenza di resveratrolo, attivatore di SIRT1, ma non dal sirtinolo, inibitore di SIRT1, o dal silenziamento di SIRT1. L’immunoprecipitazione della cromatina ha dimostrato che la subunità p65 di NF-kB si lega al promotore del gene E-selectine e questa interazione viene ridotta dalla presenza di resveratrolo.
Conclusioni Le alterazioni metaboliche presenti nei soggetti con SM si associano ad un incremento della concentrazione plasmatica di E-selectine e ad una riduzione della espressione genica di SIRT1. Nelle cellule endoteliali l’attivazione di SIRT1 mediata da resveratrolo diminuisce il rilascio di E-selectine mediante la riduzione dell’attivazione di NF-kB e dell’interazione con il promotore del gene E-selectine. Pertanto, questi risultati suggeriscono un legame tra disfunzione endoteliale e la regolazione di SIRT1 nella sindrome metabolica.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Avogaro, Angelo
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 24 > Scuole 24 > SCIENZE MEDICHE, CLINICHE E SPERIMENTALI > SCIENZE DIABETOLOGICHE
Data di deposito della tesi:27 Gennaio 2012
Anno di Pubblicazione:27 Gennaio 2012
Parole chiave (italiano / inglese):Sindrome metabolica, infiammazione, SIRT1, E-Selectine
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/13 Endocrinologia
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Scienze Medico Diagnostiche e Terapie Speciali
Codice ID:4630
Depositato il:31 Ott 2012 12:16
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