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Zuccolotto, Gaia (2012) Chimeric Antigen Receptor Engineered T cells for adoptive immunotherapy of Prostate Cancer. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

Immunology-based interventions have been proposed as a promising curative chance to effectively attack postoperative minimal residual disease and distant metastatic localizations of prostate tumors. In this regard, however, results from clinical trials have shown that a single-approach immunotherapy (antibodymediated or cell-mediated) might be insufficient to eradicate tumor cells and allows them to survive and adapt to the body’s defence mechanisms or to passively administered cures. The aim of my PhD project was the generation of CARengineered T cells specific for the human Prostate Specific Membrane Antigen (hPSMA), and their funtional evaluation in vitro and in vivo. We exploited the concept that combination of two powerful tools, by endowing T cells with recognition capacity and high specificity of antibodies, can lead to results superior to those obtained by single-approach treatments. To this aim, we developed a CAR containing both the CD3zeta and CD28 signalling moieties fused to a scFv targeting the hPSMA, to engineer human PBMC for the immunotherapy of prostate cancer. As a transfer method, we employed last-generation lentiviral vectors (LV) carrying a synthetic bidirectional promoter, capable of robust and coordinated expression of two transgenes, thus allowing to co-express the CAR in conjunction with a reporter gene (luciferase), to track the transgenic T cell population to the tumor site by in vivo optical imaging after adoptive transfer.
Overall, we demonstrated that CAR-expressing LV efficiently transduced short-term activated PBMC that, in turn, were readily stimulated to produce cytokines and exert a relevant cytotoxic activity by engagement with PSMA+ prostate tumor cells. Then, we exploited our in vivo imaging know-how and set up some experiments to precisely define the effect of the Tbodies in tumour-grafted mice and to visualize their effect in a mouse model of prostate cancer. To this end, tumour cells were transduced with a lentiviral vector coding for the reporter gene luciferase. Stably transduced cells were then used for the in vivo experiments as described above. For the analysis, mice were anaesthetized and injected with luciferin, the substrate of the enzime luciferase: the catabolyc reaction produced bioluminescence that can be visualized using Ivis Lumina II instrument (Xenogen). Last, for the setting up of a prostate cancer mouse model, we injected s.c. and i.v. luciferase-transduced PC3-hPSMA cells or PC3-WT as control. Than we evaluated the therapeutic efficacy of the Tbodies after local and systemical injection. Mice were analyzed weekly, using the Ivis Lumina II platform.
Upon in vivo transfer in tumor-bearing mice, CAR-engineered T cells survived shortly but were nonetheless capable of inducing striking therapeutic effects, thus supporting the transfer of this approach to clinical settings.

Abstract (italian)

Nell'ambito dell'immunoterapia cellulare adottiva, l’ingegnerizzazione di linfociti T con recettori diretti contro antigeni tumorali rappresenta un'efficace strategia per generare in tempi rapidi un elevato numero di linfociti tumore-specifici. In alternativa al TCR fisiologico, la cellula T può essere ingegnerizzata con recettori chimerici per l'antigene (CAR) costituiti da un dominio di riconoscimento antigenico (derivato da anticorpi monoclonali) fuso a domini di trasduzione del segnale derivati dal complesso TCR: questo tipo di struttura combina la specificità del riconoscimento anticorpale (MHC-indipendente) con le potenzialità anti-tumorali dei linfociti T. L’attività di ricerca svolta nel mio corso di Dottorato si è focalizzata sullo sviluppo di un protocollo per la generazione di linfociti T ingegnerizzati con un CAR di seconda generazione (scFv-CD28-CD3ζ) diretto contro l'antigene hPSMA (Prostate Specific Membrane Antigen) per il trattamento del carcinoma prostatico.
L'utilizzo di vettori lentivirali (LV) come alternativa ai più diffusi vettori oncoretrovirali, consente di trasdurre in modo efficace cellule T scarsamente differenziate, con positive implicazioni sulla loro funzionalità in vivo; in questo studio, inoltre, la presenza nel vettore LV di un promotore bidirezionale recentemente descritto ha permesso l'espressione coordinata del CAR e del gene reporter Firefly Luciferase con l'obiettivo di monitorare il destino biologico dei linfociti trasferiti adottivamente in vivo, mediante imaging di bioluminescenza (BLI).
La popolazione di PBMC ingegnerizzati con recettore chimerico (T-body) è caratterizzata da un'elevata percentuale di espressione del CAR anti-hPSMA (superiore al 50%), da un fenotipo di memoria e dalla capacità di riconoscere e lisare in modo specifico cellule esprimenti l'antigene. In un modello murino di tumore prostatico sottocutaneo i T-body si sono dimostrati efficaci in diversi protocolli terapeutici: co-inoculati con cellule tumorali, inoculati a livello locale, o inoculati per via sistemica in topi portatori di tumori disseminati. Contrariamente il trasferimento adottivo per via sistemica non ha determinato alcun risultato terapeutico nei tumori sottocutanei. Il monitoraggio della distribuzione in vivo dei linfociti mediante BLI ha infatti evidenziato una scarsa capacità di sopravvivenza e di homing al sito tumorale. I risultati positivi ottenuti in questo lavoro, in particolare lo sviluppo di un recettore chimerico anti-hPSMA di seconda generazione, l'utilizzo di vettori LV e la generazione di T-body funzionali in vitro e in vivo, costituiscono il razionale per ulteriori studi e per future applicazioni cliniche di questo tipo di approccio in pazienti con carcinoma prostatico; rimane tuttavia fondamentale chiarire le dinamiche di ricircolazione e distribuzione delle cellule T con l'obiettivo di implementarne la capacità di sopravvivere, ricircolare e raggiungere il sito tumorale, fattori indispensabili per mediare l'effettiva regressione della neoplasia.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Rosato, Antonio
Ph.D. course:Ciclo 24 > Scuole 24 > ONCOLOGIA E ONCOLOGIA CHIRURGICA
Data di deposito della tesi:30 January 2012
Anno di Pubblicazione:30 January 2012
Key Words:immunotherapy, chimeric antigen receptor, prostate cancer, hPSMA, tbodies, Bioluminescence, optical imaging
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/04 Patologia generale
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Scienze Oncologiche e Chirurgiche
Codice ID:4804
Depositato il:25 Oct 2012 10:22
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