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Russo, Elisa (2012) Valutazione dell'impiego di antibatterici nell'allevamento del tacchino da carne. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

Antibacterials are widely used in avian medicine and they are frequently administered by oral route in drinking water. This route of administration is a non invasive procedure and allow to treat a large number of animals at the same time, reducing time and costs. By contrast it does not allow to control the individual drug intake, thus the therapy could not be administered in a relieved way to the whole animal group. The intake of adequate drug amount is influenced by several environmental factors modifying water consumption as photoperiod, temperature, humidity and also by drug solubility in water and drug concentration, that may alter water palatability. Environmental conditions, dosages and administration routes are strictly controlled during the experimental trials for efficacy evaluation; every changes adopted to treat
infections at farms can cause different results of in field efficacy (Vermeulen et al., 2001).
A wrong drug management is one of the main causes of the wide spread antimicrobial-resistance, all over the world, in both human and veterinary medicine, the diffusion of antibacterial resistant microrganisms needs to be continuously monitored (Cantón & Morosini, 2011; ECDC & EMEA, 2009). The spread of resistant bacterial sub-population in food-producing animals is not only a veterinary problem, but it is also a public health worry, and its surveillance is mandatory (Aarestrup & Wegener 1999).
The goal of the present study, carried out in field conditions, was to update the antimicrobial efficacy of two active ingredients Enrofloxacin and Florfenicol by evaluating the resistance pattern of respiratory pathogens (E. coli and O. rhinotracheale) isolated from meat turkeys and their kinetic behaviour in turkey reared for meat production. The first study was to confirm the efficacy of Enrofloxacin, a fluoroquinolone authorised since 1990 for the treatment of turkey colibacillosis, and the second to study the efficacy of Florfenicol when used for the new therapy of O. rhinotracheale infections.
I) The MIC values of 89 strains isolated in 2009 and 2010 were determined to measure the resistance level to Enrofloxacin of Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) population in Italian commercial turkey flocks. High-level resistance was observed in the 30.3% of tested strains, while the 40.5% was intermediate and the 29.2% susceptible; MIC50 and MIC90 values were 1 mg/L and 32 mg/L, respectively.
Then to assess the efficacy of Enrofloxacin administered by pulsed medicated water to turkeys following the scheduled protocol adopted at farms a PK/PD approach was applied to the pharmacokinetic parameters obtained from kinetic studies. Ten healthy and 10 colisepticemic turkeys received 10 mg/kg of the drug dissolved in medicated water (at 89 μg/mL and 71 μg/mL, respectively), available for 10 h/day, for 5 days. On the last day of treatment blood samples were collected from all turkeys for 24 h, and serum was analyzed by HPLC with fluorimetric detection. No differences were observed between the two groups AUC values (7374.53 ± 1067.64 h•ng/mL and
7656.95 ± 1460.61 h•ng/mL) and Cmax values (673.09 ± 186.18 ng/mL and 543.50 ± 68.75 ng/mL) were obtained for healthy and ill turkeys, respectively.
The PK/PD parameters Cmax/MIC50 (0.67 and 0.54 for healthy and sick turkeys respectively) and AUC/MIC50 (7.37 and 7.66) were by far lower than efficacy breakpoint adopted for fluoroquinolones (125).
During the same study, seven healthy animals were sacrificed 3 days after the end of treatment to verify the accuracy of approved withdrawal time. Samples of the edible tissues stated by EU Regulation 2377/90 amended 470/2009 (muscle, skin plus fat, kidney and liver) were sampled to comply with MRL.
In at least one of the sampled tissues, from five out of the seven animals had Enrofloxacin residues higher than the corresponding MRL. Thus the withdrawal time approved seems to be not adequate to the scheduled treatment via medicated water and a revaluation study is mandatory.
The results of PK/PD study indicate that the authorised 10mg/kg dosage of Enrofloxacin via medicated water is ineffective against more than 70% of circulating APEC and supports the need of a revision of both dosage and treatment schedule.
II) The goal of the second part of the project was to evaluate sensitivity of O.
rhinotracheale to Florfenicol and to select the effective dosage by study Florfenicol pharmacokinetics after continuous administration in drinking water for 5 days at two different dosages 15 and 30 mg/kg and at different environmental conditions.
Florfenicol is actually authorised in poultry for the treatment of infection caused by Actinobacillus spp., Pasteurella spp., Salmonella spp., and Streptococcus spp (Interchemie, 2011)
The study was developed in three phases. The first one was the evaluation of in vitro efficacy of Florfenicol by determining the MICs of 39 O. rhinotracheale strains collected from turkey at farms and stored at Gent University; MIC50 and MIC90 were 1 mg/L and 1 mg/L, respectively.
During the second phase the pharmacokinetic of Florfenicol administered at 15 mg/kg or 30 mg/kg to healthy turkeys continuously supplied via drinking water for 5 days, was studied, using different environmental conditions.
During the kinetics at 15 mg/kg the turkeys were exposed to a photoperiod of 20h light and 4h dark and food ad libitum. The kinetic proof at 30 mg/kg was carried out with three animal groups each at different environmental conditions, two photoperiod (20h light and 4h dark or 16h light and 8h dark) and two feeding schemes (food ad libitum for the all day, food ad libitum starting 1h after the lighting) were tested. During the last day of treatment, turkeys were blood sampled and Florfenicol concentrations in plasma was determined by LC-MS.
The analysis of time-concentration curves and kinetics parameters AUC (6778.23 ± 2275.67 h•ng/mL) and Cmax (818.03 ±214.13 ng/mL) revealed that Florfenicol concentrations in plasma never attained the minimum level required to be considered effective, the MIC value of 1 mg/mL.
No significant differences were detected between the three groups treated at 30 mg/kg and exposed at different environmental conditions. AUC values (18583.65 ± 2962.02 h•ng/mL, 22883.64 ± 5305.72h•ng/mL and 21964.03 ± 2192.78 h•ng/mL) and Cmax values (1717.46 ± 34.99ng/mL, 1995.71 ± 631.45 ng/mL and 1680.89 ± 114.73 ng/mL) obtained treating turkeys at 30 mg/kg could be considered effective at all the condition but the concentrationtime curve of turkeys held with 20h light and 4h dark pointed out an erratic water and drug intake. The lack of breakpoints defined for florfenicol in the PK/PD model adopted required the confirmation of the dosage by an in vivo efficacy experiment.
Thus the third phase was an in vivo study starting with the experimental infection of four groups of meat turkeys with O. rhinotracheale. One group was not treated and was considered as positive control, all the other three were treated at 30 mg/kg with the continuous administration of Florfenicol in drinking water for 5 days, and held at different environmental condition as in the pharmacokinetic study.
The animals were scored daily on the basis of clinical examination, and tracheal swabs were collected periodically and titrated for O. rhinotracheale.
Results of this study pointed out the dosage of 30 mg/kg of Florfenicol to be effective to hold back O. rhinotracheale infection, but not to eradicate the microorganism. The group held at 20h light 4h dark had a worse response to the therapy with higher bacterial title and higher clinical score likely due to irregular blood concentration of the drug as observed during the previous kinetic study.

Abstract (italian)

Gli antibatterici nell’allevamento avicolo sono largamente utilizzati e vengono
somministrati per via orale mediante solubilizzazione del principio attivo in acqua di abbeverata. Questo sistema non è invasivo e permette di trattare un elevato numero di animali contemporaneamente riducendo i costi, ma non prevede il controllo individuale delle quote di farmaco assunto, quindi la terapia potrebbe non essere somministrata in modo uniforme a tutto il gruppo.
L’assunzione di adeguate quantità di farmaco è condizionata dalla solubilità in acqua del farmaco e dalla palatabilità dell’acqua, che può essere modificata dalle elevate concentrazioni del farmaco, e da quei fattori ambientali che possono modificare l’assunzione di acqua da parte degli animali. Tra questi il fotoperiodo, la temperatura e l’umidità del capannone. Le condizioni ambientali e le modalità di somministrazione utilizzate durante le prove sperimentali, possono differire notevolmente da quelle in allevamento e possono essere la causa discrepanze tra le valutazioni di efficacia effettuate durante le fasi sperimentali e l’efficacia in campo (Vermeulen et al., 2001).
Una gestione non corretta del farmaco si riflette in una diffusione del fenomeno dell’antimicrobico-resistenza, oggetto di costante monitoraggio in ambito internazionale sia in medicina umana che veterinaria (Cantón & Morosini, 2011; ECDC & EMEA, 2009). La diffusione di sottopopolazioni batteriche resistenti nelle specie animali destinate al consumo umano è un problema non solo di salute animale, ma anche di salute pubblica, ed è indispensabile contenerlo il più possibile (Aarestrup & Wegener 1999).
Lo scopo degli studi condotti nel triennio del dottorato di ricerca è stato quello di valutare l’efficacia di alcune terapie antibatteriche condotte nel tacchino in condizioni di campo. Nel primo studio è stata valutata efficacia di Enrofloxacina, un fluorochinolone molto utilizzato per la terapia della colibacillosi del tacchino, e nel secondo la nuova applicazione del Florfenicolo per la terapia dell’ infezione da O. rhinotracheale. In particolare sono state studiate la cinetica e le modificazioni della resistenza batterica nei microrganismi responsabili di patologie dell’apparato respiratorio nei confronti dei due principi attivi.
I) Per valutare l’attuale diffusione di resistenza all’Enrofloxacina, nel 2009 e 2010, sono stati isolati 89 ceppi di APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli) da allevamenti intensivi di tacchini da carne situati in Nord Italia, di cui è stata determinata la MIC. I ceppi resistenti erano il 30,3%, quelli intermedi il 40,5% e quelli sensibili il 29,2%, con valori di MIC50 e di MIC90 pari rispettivamente a 1 mg/L e a 32 mg/L.
Dieci tacchini sani e dieci tacchini affetti da una forma sistemica di colibacillosi sono stati trattati con la posologia autorizzata di 10 mg/kg di Enrofloxacina somministrata per os previa dissoluzione in acqua di abbeverata per 10h al giorno per 5 giorni, lo schema di somministrazione maggiormente utilizzato in campo. Durante l’ultimo giorno di trattamento, dagli animali sono stati prelevati i campioni di sangue necessari per la determinazione della cinetica ematica, e le concentrazioni di Enrofloxacina sono state determinate mediante HPLC accoppiata ad un rilevatore di tipo fluorimetrico. L’analisi dei parametri cinetici ottenuti mediante lo studio delle curve concentrazione-tempo di tutti gli animali quali area sotto la curva (AUC 7374,53 ± 1067,64 h•ng/mL e
7656,95 ± 1460,61 h•ng/mL) e concentrazione massima (Cmax 673,09 ± 186,18 ng/mL e 543,50 ± 68,75 ng/mL) non ha rivelato differenze statisticamente significative tra i gruppi sano e malato.
È stato poi applicato un modello PK/PD per valutare l’efficacia dell’Enrofloxacina dopo somministrazione pulsata in acqua di abbeverata. Il rapporto AUC/MIC50 (7,37 e 7,66) in entrambi i gruppi determina valori troppo piccoli, fortemente inferiori al breakpoint di efficacia adottato in medicina umana e veterinaria per i fluorochinoloni (125).
I risultati ottenuti indicano che il dosaggio autorizzato di Enrofloxacina 10 mg/kg nel tacchino è inefficace nei confronti di più del 70% dei ceppi circolanti di APEC e sottolinea la necessità di un riesame non solo della posologia, ma anche della modalità di somministrazione.
Durante lo stesso studio sette tacchini sani sono stati sacrificati a 3 giorni dal termine del trattamento per verificare l’adeguatezza del tempo di sospensione di 3 giorni previsto per la formulazione adottata. I tessuti edibili previsti per legge sono stati prelevati per la determinazione dei residui di farmaco (muscolo, cute più grasso, fegato e rene). Cinque animali su sette presentavano residui superiori al limite fissato per legge (MRL) in almeno uno dei tessuti analizzati, quindi il tempo di sospensione applicato sembra non essere adeguato alla posologia e alla via di somministrazione utilizzata.
II) Nel secondo studio è stata valutata l’efficacia in vitro del Florfenicolo nei confronti di O. rhinotracheale, la cinetica ematica del Florfenicolo somministrato al tacchino, a 15 e 30 mg/kg con acqua di abbeverata per 5 giorni, e la sua efficacia in vivo in tacchini infetti.
Nella prima fase sono state determinate le MIC di 39 ceppi di O. rhinotracheale isolati in campo e conservati presso la facoltà di Medicina veterinaria dell’Università di Gent nei confronti di Florfenicolo: i valori ottenuti per MIC50 e MIC90 erano rispettivamente pari a 1 mg/L e 1 mg/L.
Nella seconda fase è stata selezionata la dose efficace con le prove di farmacocinetica condotte in tacchini da carne sani trattati con 15 o 30 mg/kg die di Florfenicolo a diverse condizioni ambientali con somministrazione continua del farmaco in acqua di abbeverata per 5 giorni. Durante l’ultimo giorno di trattamento, da tutti gli animali sono stati prelevati i campioni di sangue necessari per la determinazione delle concentrazioni ematiche di Florfenicolo mediante LC-MS.
La prima prova di cinetica a 15 mg/kg è stata effettuata sottoponendo gli animali ad un fotoperiodo di 20h di luce e 4h ore di buio e cibo ad libitum.
L’analisi delle curve concentrazione-tempo e i parametri ottenuti, AUC (6778,23 ± 2275,67 h•ng/mL) e Cmax (818,03 ±214,13 ng/mL), ha rivelato che la dose 15 mg/kg è insufficiente ad avere efficacia terapeutica.
La prova di cinetica a 30 mg/kg è stata condotta su tre gruppi di animali sani sottoposti a due fotoperiodi diversi (20h luce e 4h di buio o 16 ore di luce e 8h di buio) con il cibo sempre a disposizione o con il cibo a disposizione dopo 1h dall’accensione della luce.
I valori di AUC (18583,65 ± 2962,02 h•ng/mL 22883,64 ± 5305,72 h•ng/mL 21964,03 ± 2192,78 h•ng/mL) e Cmax (1717,46 ± 34,99 ng/mL 1995,71 ± 631,45 ng/mL 1680,89 ± 114,73 ng/mL) ottenuti con la dose 30 mg/kg si sono rivelati potenzialmente efficaci. Tra i tre gruppi trattati con 30 mg/kg di Florfenicolo a differenti condizioni ambientali, solo la curva concentrazionetempo del gruppo sottoposto al fotoperiodo 20h luce 4h buio ha evidenziato un’assunzione irregolare di alimento e quindi di farmaco.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Montesissa, Clara
Ph.D. course:Ciclo 24 > Scuole 24 > SCIENZE VETERINARIE > SANITA' PUBBLICA E PATOLOGIA COMPARATA
Data di deposito della tesi:30 January 2012
Anno di Pubblicazione:January 2012
Key Words:Tacchino; antimicrobici; studi PK/PD Turkey; antimicrobials; PK/PD studies
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > VET/07 Farmacologia e tossicologia veterinaria
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Sanità pubblica, Patologia comparata ed Igiene veterinaria
Codice ID:4807
Depositato il:17 Dec 2012 11:45
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