Vai ai contenuti. | Spostati sulla navigazione | Spostati sulla ricerca | Vai al menu | Contatti | Accessibilità

| Crea un account

Zancanella, Vanessa (2012) Drug metabolizing enzymes and transporters in bos taurus and cryopreserved pig hepatocytes: constitutive expression and transcriptional modulation. [Tesi di dottorato]

Full text disponibile come:

[img]
Anteprima
Documento PDF
3096Kb

Abstract (inglese)

The exposure to xenobiotics may alter the transcription of a broad array of genes expressed in multiple tissues and vital organs such as the liver, kidney, intestine, lungs, brain, placenta, and pancreas, in order to modulate their own metabolism and excretion (Tolson & Wang, 2010). The mammalian nuclear receptor superfamily of transcription factors is involved in the first step of detoxification mechanism, regulating the gene expression of phase I and II metabolizing enzymes and drug transporters (di Masi et al., 2009). Over the past ten years, remarkable advances have been made about the nuclear receptor-dependent activation of drug metabolizing enzymes and their consequences. Despite this, such a knowledge is still restricted to human and rodent species and much less is known in veterinary species. Aim of the present PhD thesis, which is presented in form of a collection paper, was first to propose a new nomenclature for bovine cytochrome P450 sequences involved in xenobiotic metabolism through a phylogenetic analysis and, thereafter, to improve knowledge on distribution and regulation of genes involved in xenobiotic metabolism of cattle and pig, two of the most important food-producing species. For this reason the transcriptional effects of phenobarbital were investigated upon bovine hepatic and extra-hepatic tissues nuclear receptors, drug metabolizing enzymes and major uptake and efflux transporters. Furthermore, transcriptional and post-translational effects of culturing time and prototypical cytochrome 3A inducers were investigated on principal transcription factor and metabolizing enzyme coding genes in long-term stored cryopreserved pig hepatocytes.
The phylogenetic analysis pointed out several inconsistencies between currently used cattle cythochromes P450 names and true evolutionary relationship among cytochrome P450 isoforms. Name changes mostly mirrored the orthologous counterparts established for other species, and new names were created when no clear orthologous sequences were identified. With regard to drug metabolizing enzymes and drug transporter expression in cattle tissues, the obtained information confirm for the most part data obtained in humans and rodent model species. Therefore, even if present results are not suggestive of a clear bovine-specific pattern of gene expression, the existence of a tissue-specific mechanism of cythochromes P450 induction cannot be excluded. Phenobarbital, orally administered at inducing dosages, up-regulated cattle hepatic cytochrome 2B, 2C and 3A, as well as the major conjugative enzymes UDP glucuronosyltransferase 1A1-like and glutathione S-transferase α 1-like. In extrahepatic tissues, results showed a different responsiveness to phenobarbital when compared to liver. A general trend to inhibition was observed in small intestine, and the sulfotransferase 1A1-like gene expression was significantly inhibited. About drug transporters, liver, intestine and testis were proved to be tissues mostly involved in transport activity and, ATP-binding cassette C2 mRNA was shown to be significantly up-regulated by phenobarbital in the liver. By contrast, renal ATP-binding cassette G2 mRNA was inhibited. Likewise to former studies made in primary or cryopreserved hepatocytes obtained from different species (including the pig, too), a time-dependent down-regulation of cytochrome mRNAs and proteins was observed, whereas nuclear receptor gene expression data showed some differences in terms of response (crash and rise effect, up-regulation, no effect). When exposed to prototypical cytochrome 3A inducers, both nuclear receptor (essentially following the incubation with dexamethasone) and cytochromes gene expression profiles were up-regulated; furthermore, phase I enzymes modulation was confirmed at the post-translational level, although to a lower extent.
In conclusion, the gene expression profiling represents nowadays a helpful and sensitive method, compared to protein and catalytic activity assays, to detect a modulation of drug metabolizing enzymes expression and function following a xenobiotic exposure. Our findings on cattle nuclear receptors, drug metabolizing enzymes and transporters gene expression and possible modulation contributed to improve the knowledge on comparative drug metabolism.. Likewise, cryopreserved pig hepatocytes have been shown to be, even if stored for longer times than usual, an useful tool to study the expression and regulation of genes requiring a functional transcription factor machinery.

Abstract (italiano)

L’esposizione a xenobiotici può modulare la trascrizione di un ampio spettro di geni espressi in tessuti ed organi diversi tra cui fegato, rene, intestino, polmone, cervello, placenta e pancreas al fine di favorirne il metabolismo ed il processo di escrezione (Tolson e Wang, 2010). La superfamiglia genica dei fattori di trascrizione codificante per i recettori nucleari è responsabile dell’attivazione del meccanismo di detossificazione dello xenobiotico regolando, a livello trascrizionale, l’espressione degli enzimi del metabolismo di fase I e II, nonché di fase III (trasportatori di membrana; di Masi et al., 2009). Nel corso degli ultimi dieci anni, nell’uomo e nelle specie da laboratorio è stato chiarito il meccanismo di attivazione dei geni regolati dai recettori nucleari; nonostante ciò, poche informazioni sono tutt’ora disponibili per quanto riguarda le specie di interesse veterinario. Scopo di questa Tesi di Dottorato, presentata in forma di “collection papers” è stato in primis di proporre una nuova nomenclatura tramite un’accurata analisi filogenetica, per le sequenze di bovino del citocromo P450 coinvolte nel metabolismo degli xenobiotici. In seguito, sono state implementate le conoscenze riguardanti la distribuzione tissutale e la regolazione degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici nel bovino e nel suino, due delle specie veterinarie da reddito più importanti. A questo proposito, è stato condotto uno studio volto a delucidare gli effetti pre-trascrizionali del fenobarbitale, nel fegato e in tessuti extra-epatici di bovino, sui principali recettori nucleari, enzimi biotrasformativi e trasportatori di membrana,. Oltre a ciò, in epatociti crioconservati di suino, sono stati valutati gli effetti a livello trascrizionale e post-traduzionale del tempo in coltura e di classiche molecole induttrici del citocromo 3A sui principali recettori nucleari ed enzimi di fase I.
L’analisi filogenetica ha rivelato numerose imprecisioni nell’attuale nomenclatura utilizzata per le sequenze di citocromo P450 nel bovino. I cambiamenti proposti riprendono prevalentemente la nomenclatura in uso per la specie la cui sequenza è risultata ortologa a quella di bovino, mentre, per le sequenze alle quali non è stato possibile assegnare con certezza una relazione di ortologia, è stato creato un nuovo acronimo. La distribuzione tissutale nel bovino osservata per i fattori di trascrizione, enzimi del metabolismo e trasportatori presenta alcune caratteristiche comuni con l’uomo e specie da laboratorio. I risultati ottenuti non sarebbero pertanto indicativi di un profilo di espressione bovino-specifico di tali geni, anche non si può escludere la presenza di un meccanismo di induzione tessuto-specifico. Il fenobarbitale ha indotto a livello epatico la trascrizione dei citocromi appartenenti alle famiglie 2B, 2C e 3A nonché quella di enzimi coniugativi quali l’UDP glucuronosiltransferasi 1A1-like e la glutatione S-transferasi α 1-like. Per quanto riguarda i tessuti extra-epatici, nell’intestino è stato osservato un generale effetto inibitorio (significativo per sulfotransferasi 1A1-like). Anche nel bovino, il fegato, l’intestino e il testicolo si sono rivelati essere gli organi che esprimono geni codificanti per proteine di afflusso ed efflusso e l’espressione del trasportatore ATP-binding cassette C2 è stata significativamente aumentata a livello epatico dal fenobarbitale. Diversamente, nel rene il livello di mRNA dell’ ATP-binding cassette G2 è stato significativamente ridotto. Similmente a quanto riportato in studi effettuati in precedenza su epatociti primari di diverse specie (inclusa quella suina) preparati a fresco e crioconservati, è stata osservata una diminuzione in funzione del tempo nel contenuto di citocromo P450 (sia livello di trascritto sia di proteina), mentre per i recettori nucleari non è stata evidenziata nessuna differenza in termini di risposta. L’esposizione a molecole induttrici del citocromo 3A (soprattutto a desametasone) ha significativamente indotto l’espressione dei geni codificanti per i recettori nucleari e gli enzimi di fase I, e per quest’ultimi tale modulazione è stata confermata anche a livello post-traduzionale.
Concludendo, lo studio dei profili di espressione genica si è rivelato un metodo precoce e sensibile per determinare la modulazione degli enzimi del metabolismo da parte degli xenobiotici rispetto agli studi effettuati a livello proteico e di attività catalitica. I risultati ottenuti dallo studio della distribuzione tissutale e di induzione dei recettori nucleari, enzimi deputati al metabolismo e dei trasportatori nel bovino contribuiscono ad implementare la conoscenza del metabolismo non solo nel fegato ma anche nei tessuti extra-epatici. Infine, è stato dimostrato che gli epatociti crioconservati di suino, anche se stoccati per lungo tempo, possono considerarsi uno strumento valido per lo studio dei meccanismi di regolazione di quei geni che richiedono un inalterato apparato trascrizionale.

Statistiche Download - Aggiungi a RefWorks
Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Dacasto, Mauro
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 24 > Scuole 24 > SCIENZE VETERINARIE > SANITA' PUBBLICA E PATOLOGIA COMPARATA
Data di deposito della tesi:30 Gennaio 2012
Anno di Pubblicazione:30 Gennaio 2012
Parole chiave (italiano / inglese):Bos taurus, cattle, cytochrome P450, phylogeny, evolution, SLC-transporters, ABC-transporters, conjugative enzymes, nuclear receptors, extrahepatic tissues, phenobarbital, induction, gene expression, cryopreserved pig hepatocytes, long-term cryopreservation.
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > VET/07 Farmacologia e tossicologia veterinaria
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Sanità pubblica, Patologia comparata ed Igiene veterinaria
Codice ID:4820
Depositato il:25 Ott 2012 17:30
Simple Metadata
Full Metadata
EndNote Format

Download statistics

Solo per lo Staff dell Archivio: Modifica questo record