Vai ai contenuti. | Spostati sulla navigazione | Spostati sulla ricerca | Vai al menu | Contatti | Accessibilità

| Crea un account

Damiano, Nunzio (2012) Transglutaminase-mediated modification of proteins:
Molecular mechanisms and metal-labelling of proteins.
[Tesi di dottorato]

Full text disponibile come:

[img]
Anteprima
Documento PDF
5Mb

Abstract (inglese)

Abstract

Transglutaminase (TGase) is a 331-residue monomeric microbial enzyme produced by recombinant methods, easily available from a commercial source and well characterized in structural terms. TGase catalyzes the reaction between the γ-amido group of a protein-bound Gln residue (–CONH2, the acceptor) and an amino group (–NH2, the donor) of an alkyl-amine. This enzymatic approach appears to be mild and specific for glutamine (Gln) and lysine (Lys) residues of a protein. Indeed, initial experiments have already established that TGase can be used for an effective modification of proteins. In this PhD project we have used microbial TGase for the site-specific modification of proteins at the level of Gln or Lys residue(s) by using different substrates for the enzymatic reaction. In particular, we aimed also to prepare protein derivatives containing covalently-bound peptide moieties capable of chelating metals and radionuclides.



The TGase-mediated labelling of proteins has been examined in detail using protein substrates of known 3D structure and dynamics in order to unravel the conformational and dynamic features that dictate preferential or specific protein modification by TGase. Avidin and apo-α-lactalbumin were respectively modified with carbobenzoxy-glutaminyl-glycine (ZQG) and dansyl-cadaverine. In both cases, modified proteins were purified by RP-HPLC and analyzed by mass spectrometry (MS) in order to identify the sites of the modification. The results of these analyses indicated that in the case of avidin there is a double modification of the protein, while in the case of apo-α-lactalbumin there is only one site of modification. Interestingly, both proteins are derivatised by TGase at the level of Gln or Lys residues located at flexible regions of their structure, as deduced from the crystallographically determined B-factor profile along the polypeptide chain of the protein. Moreover, it was shown that there is a correlation between sites of TGase attack and sites of limited proteolysis, indicating that both TGase and a protease require some local unfolding of the protein substrate for their selective enzymatic reactions.

We have also designed and synthesised two peptides that can function as suitable metal-chelating agents. These chelating peptides contain a cysteine (Cys) residue at the C-terminus that can coordinate metals as technetium (99mTc) or rhenium (186/188Re) with the thiol group and C-terminal carboxylic group acting as ligands for the metal. Moreover, these peptides contain a Lys or Gln residue that can be exploited for their TGase-mediated conjugation to proteins. The complexes of these peptides with 99mTc and 185/187Re were purified and characterised in terms of metal binding properties. Experiments are now in progress in order to use TGase for the site-specific conjugation of these metal-chelating peptides to proteins that can be used as imaging agents.

Abstract (italiano)

RIASSUNTO

La transglutaminasi (TGase) microbica è un enzima di 331 residui amminoacidici prodotta con metodi ricombinanti, facilmente reperibili da una fonte commerciale e ben caratterizzata in termini strutturali. La TGase catalizza la reazione tra il gruppo γ-ammidico di un residuo di glutammina (Gln) (-CONH2, accettore) ed un gruppo amminico (-NH2, donatore) di una alchil-ammina, ad es., il gruppo -amminico di una lisina (Lys). Le reazioni mediate da TGase avvengono in condizioni blande ed inoltre con notevole specificità, soprattutto per i residui di Gln. La TGase può essere utilizzata per la modifica enzimatica di proteine a livello di Gln, ma anche di Lys. Lo Schema illustra la possibilità di utilizzare nella reazione di una proteina con TGase un ligando in grado di mimare sia la catena laterale di Gln che Lys, potendo in tal modo, con opportuni ligandi, introdurre covalentemente in una proteina un gruppo fluorescente, un farmaco o anche un complesso metallo-peptide.



In questa Tesi di dottorato la TGase è stata usata per la modifica di proteine modello, tra cui -lattalbumina, avidina ed apomioglobina (apoMb). Lo scopo della ricerca è stato quello di comprendere i motivi strutturali che determinano la specificità di azione della TGase. Inoltre, la modifica di proteine con TGase è stata condotta utilizzando substrati peptidici in grado di legare metalli e radionuclidi.

La modifica di proteine con TGase è stata esaminata in dettaglio utilizzando proteine di struttura 3D e dinamiche note, al fine di individuare le caratteristiche conformazionali e dinamiche che determinano la modifica preferenziale o specifica. L’avidina e l’apo-α-lattalbumina sono state modificate utilizzando carbobenzoxy-glutaminyl-glicina (ZQG) (donatore) e dansyl-cadaverina (accettore). Le proteine modificate sono state purificate mediante RP-HPLC ed analizzate mediante spettrometria di massa (MS) al fine di individuare i siti di modifica. I risultati di queste analisi hanno indicato che le modifiche di queste proteine avvengono a livello di residui di Gln e Lys localizzati in regioni flessibili della loro struttura, come si deduce dai valori di fattore-B (parametro di flessibilità) della loro catena polipeptidica. Inoltre, è stato dimostrato che esiste una correlazione tra i siti di attacco di TGase ed i siti di proteolisi limitata, indicando che sia la TGase che una proteasi richiedono una certa flessibilità del substrato polipeptidico affinchè la reazione possa avvenire.

Sono stati anche progettati e sintetizzati due peptidi in grado di fare complessi con metalli. Questi peptidi, contenendo una cisteina (Cys) quale residuo al C-terminale, sono in grado di coordinare metalli con il gruppo tiolo ed il gruppo carbossilico, tra cui tecnezio (99mTc) o renio (186/188Re). Inoltre, questi peptidi contenevano un residuo di Gln o Lys, ai fini di un riconoscimento da parte della TGase per la loro coniugazione covalente ad una proteina. I complessi di questi peptidi con 99mTc e 185/187Re sono stati purificati e caratterizzati in termini di proprietà leganti per i metalli ed utilizzati per la modifica di proteine. Ulteriori esperimenti sono in corso al fine di utilizzare la TGase per la modifica sito-specifica di proteine con questi metallo-peptidi, al fine di sviluppare una strategia di produzione di proteine marcate da usare per analisi di imagin.

Statistiche Download - Aggiungi a RefWorks
Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Fontana, Angelo
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 24 > Scuole 24 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > BIOTECNOLOGIE
Data di deposito della tesi:30 Gennaio 2012
Anno di Pubblicazione:30 Gennaio 2012
Parole chiave (italiano / inglese):transglutaminase
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/10 Biochimica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Scienze Farmaceutiche
Codice ID:4860
Depositato il:05 Nov 2012 12:55
Simple Metadata
Full Metadata
EndNote Format

Download statistics

Solo per lo Staff dell Archivio: Modifica questo record