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Marchiani, Anna (2012) Interaction studies of small natural derived compounds and peptides with beta-synuclein. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

Proteins play a crucial role in preservation of life and their dysfunction may cause different pathological conditions. Indeed, the incorrect folding of a protein can trigger neurodegenerative diseases. A wide range of diseases, known as β-œProtein misfolding disorders-❠come from the inability of specific proteins to adopt their correct structure or native state and are characterized by the deposition of fibrillar aggregates of proteins, called amyloids, that eventually lead to cellular suffering and death. More than 20 systemic and neurodegenerative diseases are linked to this event, among which we found the well-known Alzheimer and Parkinson disease. Although there are no similarities between the proteins involved in these diseases, they show a common organization and morphology. Amyloid fibrils are made of protofilaments twisted around each other, with β-strands running perpendicular to the fibril axis. The mechanism by which these aggregates lead to cell death is not well understood, but it is established that prefibrillar aggregates and not the mature fibrils are the most toxic species, maybe because they interact with plasma membrane forming pore-like structures that interfere with cellular homeostasis.
β-Synuclein is a 140 amino acid presynaptic protein whose function is not well known. It has been identified in the amyloid deposits in several neurodegenerative diseases and mostly in Lewy bodies, the filament inclusions distinguished in Parkinson disease. β-Synuclein aggregation is considered one of the causes of Parkinson disease and a triplication or point mutations in the gene that encodes for synuclein are connected to autosomal dominant early-onset Parkinsonism. Today, there are no efficient therapies against Parkinson and the inhibition of protein aggregation represents one of the most promising therapeutic strategies; specifically research is focused on the development of small organic molecules or peptides that may hamper this process.
Curcumin, or diferuloylmethane, is the main principle of Turmeric, a well-known Indian spice. Several properties have been proposed and then confirmed by modern medicine for curcumin, including antioxidant and antiinflammatory activities, and its ability to inhibit fibril formation in vivo and in vitro by direct binding to amyloid aggregates has been recently proposed. It has been shown that curcumin can interact with different types of fibrils, so curcumin has been proposed as a general inhibitor of aggregation. Unfortunately curcumin is insoluble in aqueous solution, it has poor bioavailability, and rapidly degrades at neutral or basic pH. All these problems limit the therapeutic use of curcumin. Dehydrozingerone, a natural compound extracted from the plant Zingiber officinale corresponding to half curcumin is also one of its degradation byproduct, but it is more water soluble and stable than curcumin. Deydrozingerone has been demonstrated to possess antioxidant activity as well. Ferulic acid, another degradation product of curcumin with similar structure to dehydrozingerone, shows antioxidant and anti-inflammatory properties, as well as the ability to inhibit amyloid- fibril deposition (or β, one of the main components of neuritic plaques in Alzheimer disease). These observations leads to the hypothesis that phenols with antioxidant properties and with a structure that resembles curcumin, may be able to inhibit the aggregation of β-synuclein.
This research evaluate the capability of curcumin and dehydrozingerone analogues (O-methoxydehydrozingerone, zingerone and their biphenylic analogues), to interact with the monomeric form of human β-synuclein. Results obtained by CD and fluorescence spectroscopies revealed that all these compounds interact with synuclein, even though with different affinity. Moreover, their ability to inhibit the aggregation of β-synuclein was also tested.
Another important aspect to be considered in Parkinson disease and generally in misfolding disorders is the role of metal ions. Indeed, high levels of metal ions have been detected in the brain of Parkinson patients. These ions can generate H2O2 that can be further converted into the most toxic hydroxyl radical, the main responsible of the oxidative stress associated with this pathology. The ability of dehydrozingerone and analogues to chelate metal ions, specifically Cu2+, Fe2+ and Fe3+, has been evaluated by UV-Vis spectroscopy. Moreover, the ability of these compounds to scavenge free radicals was estimated by both UV-Vis and and EPR studies using the DPPH test. Except for O-methoxydehydrozingerone and its biphenylic analog, all the compounds showed good antioxidant activity, increased by dimerization. Finally, their cellular toxicity and their protective effect against oxidative stress insults have been evaluated. This study revealed the bifuctional activity of these curcumin-like molecules, i.e., their ability to chelate metal ions or to scavenge free radicals, together with their capability to interact with β-synuclein.
Additionally. β-sheet breaker peptides have been synthesized and tested as ligands of synuclein. The term β-sheet breaker refers to small peptide sequences able to interfere with the aggregation process of misfolded protein. Nine peptides, analogues to two sequences able to inhibit protein aggregation, and containing some substitutions in the sequence to overcome some of the drawbacks connected with the use of peptides in therapy (e.g., degradation by proteases), and improve their inhibitory activity have been synthesized by Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS). The influence of the aromatic residue phenylalanine into one sequence in peptide interaction with β-synuclein has been studied using conformational constraints of this residue. Binding studies by CD and fluorescence spectroscopies revealed that all the peptides are able to bind the β-synuclein monomer and that the phenylalanine residue is not important for the interaction with synuclein

Abstract (italian)

Le proteine giocano un ruolo cruciale nella conservazione della vita e una loro disfunzione può essere causa di differenti condizioni patologiche. Infatti, il non corretto ripiegamento di una proteina può essere causa di patologie neurodegenerative. Un ampio gruppo di malattie, note come œprotein misfolding disordersò nascono dall'™incapacità di specifiche proteine di adottare la loro struttura nativa e sono caratterizzate dalla deposizione in aree specifiche dell'™organismo di proteine in forma di aggregati fibrillari che sono considerati causa della sofferenza e della morte cellulare. Oltre 20 sono le malattie sistemiche e neurodegenerative collegate a questo evento, tra le quali si ritrovano le più note patologie di Alzheimer e Parkinson. Sebbene non si riscontrino somiglianze tra le proteine correlate a tali patologie, le fibrille amiloidi presentano un'organizzazione e morfologia comune. La struttura delle fibrille amiloidi consta di protofilamenti avvolti tra loro costituiti da impilamenti a β-sheet che si propagano lungo la direzione della fibrilla. Non si conosce ancora bene il meccanismo con cui questi aggregati portano a morte cellulare, ma è ormai certo che gli aggregati pre-fibrillari, e non i depositi di fibrille mature, siano responsabili della tossicità, forse per interazione con la membrana plasmatica e formazione di pori che rompono l'omeostasi cellulare.
La β-sinucleina è una proteina presinaptica di 140 amminoacidi la cui funzione non è ancora ben nota. Essa è stata identificata nei depositi amiloidei di differenti patologie neurodegenrative e soprattutto nei corpi di Lewy, inclusioni filamentose caratteristiche della malattia di Parkinson. L'aggregazione di tale proteina è oggi ritenuta una delle cause del Parkinson e una triplicazione dell'™espressione del suo gene o mutazioni puntiformi sono associate ad una forma autosomica dominante di Parkinson giovanile. Ad oggi non esiste ancora una cura efficace per il Parkinson e l'™inibizione dell'™aggregazione proteica rappresenta una delle strategie terapeutiche più promettenti; in particolare la ricerca è rivolta allo sviluppo di piccole molecole organiche o piccoli peptidi che interferiscano con tale processo.
La curcumina, o diferuloilmetano, è il principale costituente del Curry, nota spezia di origine Indiana. Alla curcumina sono state associate e in seguito dimostrate dalla moderna medicina differenti proprietà, tra cui capacità antiossidanti e antiinfiammatorie, e di recente, la capacità di bloccare la formazione di fibrille in vivo ed in vitro, andandosi a legare direttamente agli aggregati amiloidei. E' stato dimostrato che la curcumina, più che ad una specifica proteina, abbia la capacità generale di legare fibrille amiloidi, ipotizzando quindi che essa agisca come generale inibitore dell'aggregazione. Sfortunatamente la curcumina è insolubile in ambiente acquoso, presenta scarsa biodisponibilità e degrada rapidamente a pH neutro o basico. Tutti questi problemi limitano l''™uso terapeutico della curcumina. Il deidrozingerone è un composto naturale estratto dallo Zingiber officinale e strutturalmente corrisponde a metà curcumina. Esso risulta essere uno dei prodotti di degradazione della curcumina ma è stabile a pH neutro o basico e inoltre possiede maggior solubilità in solvente acquoso. Per il deidrozingerone sono state riportate proprietà  antiossidanti. L€'acido ferulico, un altro prodotto di degradazione della curcumina e strutturalmente simile al deidrozingerone, presenta attività antiossidanti e antiinfiammatorie, oltre alla capacità di inibire la deposizione di fibrille del peptide β (uno dei principali componenti delle placche senili nell'™Alzheimer). Alla luce di queste considerazioni è ipotizzabile che fenoli con proprietà  antiossidanti e struttura simile alla curcumina possano anch'™essi possedere proprietà inibitorie nei confronti dell'™aggregazione del β-sinucleina.
In questo progetto l'™attenzione è stata focalizzata sulla curcumina e su altre 6 molecole di struttura simile (deidrozingerone, zingerone, O-metossideidrozingerone e i corrispondenti analoghi bifenilici) ed è stata valutata la loro capacità di interagire con la forma monomerica della sinucleina. Dalle analisi effettuate mediante spettroscopia CD e di fluorescenza è stato evidenziato come tutti i composti in esame siano in grado di interagire con la sinucleina, e le relative costanti di binding sono state determinate. Inoltre è stata valutata la capacià  inibitoria di questi composti nei confronti del processo di aggregazione del β-sinucleina.
Un altro aspetto di notevole importanza è il ruolo degli ioni metallici nel Parkinson e più in generale nella patologie da misfolding proteico. Sono stati infatti evidenziati elevati livelli di ioni metallici redox-attivi nel cervello di pazienti affetti da Parkinson. Tali ioni possono generare H2O2 che poi può essere convertita nel più aggressivo radicale idrossile, principale responsabile del danno ossidativo associato a tale patologia. La capacità di deidrozingerone e dei suoi analoghi di chelare ioni metallici, in particolare Cu2+, Fe2+ e Fe3+ è stata quindi valutata mediante spettroscopia UV-Vis. Questo ha permesso di evidenziare come i derivati bifenilici siano dei buoni chelanti degli ioni metallici. Inoltre, è stata determinata la capacità  dei composti oggetto di studio di sequestrare radicali liberi mediante DPPH test e studi EPR. Ad eccezione di O-metossideidrozingerone e del suo analogo bifenilico, gli altri composti hanno dimostrato una buona capacità antiossidante, e, in particolare, si è osservato come la dimerizzazione aumenti tale capacità. Infine, è stata valutata la loro tossicità cellulare e la loro efficacia protettiva nei confronti di insulti da stress ossidativo: tra tutti i composti il bi-O-metossideidrozingerone si è dimostrato il più tossico a livello cellulare. Tale studio ha quindi voluto mettere in risalto la bifunzionalità  delle molecole in esame, ossia la loro capacità  di agire da chelanti di ioni metallici o sequestratori di radicali liberi associata alla loro capacità  di interagire con la sinucleina.
Un'™altra parte del progetto riguarda la sintesi di peptidi aventi proprietà β-sheet breakers. Tale termine viene utilizzato per indicare piccole sequenze peptidiche in grado di interferire con il meccanismo di misfolding e aggregazione proteica. Mediante la tecnica SPPS (solid phase peptide synthesis) sono stati sintetizzati 9 peptidi analoghi a due sequenze capaci di inibire l'™aggregazione proteica e contenenti delle sostituzioni nella sequenza peptidica al fine di superare alcuni svantaggi associati all'™uso di peptidi in terapia (es.: degradazione da parte di proteasi), migliorare le loro capacità inibitorie e analizzare l'™importanza del residuo aromatico fenilalanina nell''™interazione con la sinucleina. Studi di binding mediante spettroscopia CD e di fluorescenza hanno evidenziato come tutti i peptidi siano in grado di interagire con la sinucleina monomero e come la presenza del residuo di fenilalanina non sia importante nell''™interazione con la proteina

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Mammi, Stefano
Supervisor:Ruzza, Paolo
Ph.D. course:Ciclo 24 > Scuole 24 > SCIENZE MOLECOLARI > SCIENZE CHIMICHE
Data di deposito della tesi:30 January 2012
Anno di Pubblicazione:30 January 2012
Key Words:misfolding, synuclein, β-sheet breakers, curcumin, dehydrozingerone
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 03 - Scienze chimiche > CHIM/06 Chimica organica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Chimiche
Codice ID:4894
Depositato il:29 Oct 2012 11:37
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