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Biscontin, Alberto (2012) The dynamic changes of expression signatures in the larval development of mytilus gallopronvincialis. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Bivalves are some of the most studied marine organisms for ecological importance as bio-indicators and economic value in shellfish farming. They have a planktonic life stage, spending about 4 weeks as free-swimming larvae in the water column and probably this is an evolutive advantage making the most common marine molluscs. A variety of physical, biological, and genetic factors influence the initial larvae pelagic dispersion and the subsequent soil settlement. During larval stages bivalves are characterized by a very fast growth, and by morphological and metabolic changes pointed to the accomplishment of metamorphosis into adult organism. These radical modifications are probably due to the activation of different gene expression patterns associated with each developmental stage.
The aim of my PhD project was to define the transcriptional signatures of 6 larval stages in Mytilus galloprovincialis to provide a comprehensive overview on the biological processes underlying the larval development.
In 2009 we performed the stimulation of bivalves mating to collect samples of fertilized eggs and each larval stage. Total RNA have been extracted and each sample was fixed 4% paraformaldehyde for in situ hybridization.
We set up seven stage-specific 3'-end cDNA libraries in order: i) to discover specifically expressed transcripts in larval stages, and ii) to define the first transcriptional signature of larval development in M. galloprovincialis, calculating the 3’-EST frequency at each stage. Using pyrosequencing technology (Roche 454 Titanium), we have generated a total of 751,872 high quality reads characterized by a median length of 315 bp. The assembling process (Newbler 2.5.1) of pyrosequencing reads and ESTs, previously produced by our lab (Mytibase), resulted in 14,364 unique sequences/putative transcripts and 55,493 singletons. We counted the number of reads that align with each unique sequence at each stage-specific library defining the expression pattern of each stage.
After the annotation process we were able to estimate a gene discovery rate of about 45% rising to 60% in the early larval stages characterized by a lot of unknown genes. Quantitative real time PCR analysis was performed to quantify and validate the expression profile of some genes on samples collected during a new mussel mating experiment, performed at the beginning of 2011. On the basis of the high correlation values between the qRT-PCR and sequencing data, we can consider the counts reliable. A negative binomial test was performed to identify differentially expressed transcripts between at least two stages. In particular the 25% of genes results to be differentially expressed and we observed the main differences comparing early larval stages, including trocophora and D-larva, and late larval stages, including umbo stage, pediveliger, and metamorphic larva. Differentially expressed genes showing similarity with known genes or proteins were grouped into functional categories according to Gene Ontology in order to identify the biological categories involved in development such as organ development, growth control, biomineralization, and byssus secretion.
Finally we are performing whole mount in situ hybridization of the most differentially expressed unknown genes to start their functional characterization defining their morphological localization.
We defined the first transcriptional signatures of larval stages in M. galloprovincialis in order to better understand the molecular mechanisms involved in the process of development from larva to the adult.

Abstract (italiano)

I bivalvi sono la classe di organismi marini più studiata, sia per il loro ruolo ecologico di bioindicatori del grado di inquinamento costiero, sia per la loro rilevanza economica nel settore alimentare. Il loro sviluppo larvale è caratterizzato da una rapida crescita e da profondi cambiamenti morfologici e metabolici volti al raggiungimento dello stadio adulto. I radicali mutamenti a cui l’organismo va incontro sono riconducibili all’espressione coordinata di specifici geni.
Lo scopo del mio progetto di dottorato è stato quello di definire i profili trascrizionali associati a ciascuno dei 6 stadi di sviluppo larvale di Mytilus galloprovincialis per far luce sui processi biologici alla base dell sviluppo larvale.
Nel 2009 abbiamo riprodotto in laboratorio il naturale processo di fecondazione tra 8 femmine e 20 maschi inducendo l’emissione dei gameti. Abbiamo quindi raccolto campioni di RNA totale dell’uovo fecondato e di ciascuno stadio larvale e abbiamo inoltre conservato in paraformaldeide alcune larve per effettuare esperimenti di ibridazione in situ.
A partire dall’RNA totale estratto abbiamo allestito sette librerie stadio specifiche costituite da frammenti 3’ terminali di cDNA. Queste sono state sequenziale con le moderne tecnologie di sequenziamento massivo così da ottenere sia le sequenza di trascritti espressi durante gli stadi larvali, sia una stima del loro profilo di espressione nei vari stadi larvali calcolando la loro frequenza di rappresentazione in ciascuna libreria. Per il sequenziamento ci siamo avvalsi della tecnologia 454 (Roche) che ci ha permesso di ottenere 751,872 reads caratterizzate da una lunghezza mediana di 315 bp. Le reads ottenute sono state assemblate con sequenze prodotte precedntemente dal nostro laboratorio e depositate su MytiBase ottenendo 14,364 sequenze consensus e 55,493 singletons. Quindi abbiamo calcolato il numero di reads che si allineano con ciascun trascritto in ciascuna libreria stadio specifica così da ottenere una stima dei profili trascrizionali associati a ciascuno stadio di sviluppo larvale.
Sfruttando un algoritmo da noi sviluppato siamo riusciti ad annotare il 55% dei trascritti. Per verificare l’attendibilità delle conte come mezzo per stimare l’espressione genica abbiamo eseguito una serie di esperimenti di PCR quantitativa su un nuovo campionamento biologico eseguito all’inizio del 2011. Sulla base dell’elevata correlazione tra i dati di espressione stimati con le due tecnologie indipendenti possiamo giudicare affidabile il nostro approccio. Tramite un test binomiale negativo abbiamo determinato che il 25% dei trascritti risulta differenzialmente espresso in almeno due stadi di sviluppo. Inoltre le maggiori differenze di espressione si rilevano confrontando gli stadi precoci (troco fora e larva D) con quelli tardivi (larva umbonata, pediveliger e larva metamorfica). Mediante analisi di Gene Ontology abbiamo individuato i processi biologici maggiormente implicati nello sviluppo larvale quali ad esempio il controllo della crescita, lo sviluppo degli organi e i processi di biomineralizzazone e sintesi del bisso.
Infine stiamo eseguendo degli esperimenti di ibridazione in situ per incominciare la caratterizzazione di alcuni dei geni, differenzialmente espressi ma non annotati, definendo la loro localizzazione.
Concludendo, abbiamo ottenuto la prima stima dei profili trascrizionali associati a ciascuno stadio larvale di M. galloprovincialis per comprendere i meccanismi molecolari su cui fonda il processo di sviluppo larvale.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Lanfranchi, Gerolamo
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 24 > Scuole 24 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > GENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE DELLO SVILUPPO
Data di deposito della tesi:30 Gennaio 2012
Anno di Pubblicazione:30 Gennaio 2012
Parole chiave (italiano / inglese):mytilus galloprovincialis larval development expression next-generation sequencing
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/18 Genetica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Centri > Centro di ricerca Interdipartimentale Biotecnologie Innovative (CRIBI)
Codice ID:4906
Depositato il:06 Nov 2012 10:03
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