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Albania, Lara (2012) Longins and the longin domain: pivotal elements in subcellular trafficking and neuronal differentiation. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors (SNAREs) are the most investigated trafficking proteins due to their role in directing the fusion complex. Among these, long VAMPs, or longins are characterized by N-terminal longin domain (LD), controlling both SNARE complex formation and subcellular localization (SCL) and are prototyped by VAMP7, Sec22b and Ykt6. The LD adopts a stable, closed conformation, but the contribution of this state and each different domain to sorting is still unclear. Human VAMP7, encoded by gene SYBL1, is involved in multiple cell pathways, including control of neurite outgrowth. Furthermore, alternative splicing (AS) of SYBL1 results in the production of two isoform subfamilies that retain an intriguingly domain architecture. Non-SNARE longin variants share the inhibitory LD, whereas non-longin SNARE variants share the SNARE motif. Since previous evidence suggests inhibitory functions for the LD construct and growth promoting activity for the Δ-longin construct, these subfamilies are likely to play opposite functions. Therefore, mechanisms mediating neurotogenesis are not clear, in particular the contribution of extracellular stimuli and different SNAREs. This work focused on the characterization of VAMP7 LD and its isoforms in SCL and neuronal development. Expression analysis in different tissues and cell lines, real time RT-PCR and confocal microscopy analyses demonstrated that VAMP7 variants have different tissue specificities and SCL; furthermore, the LD-only isoform VAMP7i displays also a nuclear localization. Considering their variant domain combinations, these physiological splice variants were used as tools for studying targeting determinants in SCL. Moreover, recombinant fragments of the VAMP7a cytoplasmic region confirmed that individual domains are unable to determine sorting by alone, and open/closed conformational switch is not relevant to SCL in the absence of transmembrane region. Gain-of-function experiments on both neuroblastoma cells and primary neurons revealed that VAMP7 AS is able to regulate neurite outgrowth by balanced production of stimulatory (VAMP7dh) and inhibitory (VAMP7i) isoforms. These effects are also subjected to the substrate (Poly-D-Lysine or Laminin) in which neurons are cultured and to the co-expression of other VAMP7 isoforms or SNAREs (VAMP2), suggesting a fine regulatory mechanism mediated by VAMP7 AS. Additional investigation will be helpful in order to manipulate neuritogenesis in cell therapy and clarify the role of tissue-specific variants in some neurological diseases. Further characterization of VAMP7 LD and isoforms can unravel novel molecular partners and mechanisms, helpful in some biotechnological applications.

Abstract (italiano)

Le proteine SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors) sono le più studiate nell’ambito del traffico subcellulare, dato il loro ruolo nella formazione del complesso di fusione delle membrane. In questa famiglia, le VAMP lunghe o longine sono caratterizzate da un dominio N-terminale denominato longin (LD), che ha una funzione sia nella formazione del complesso SNARE, sia nella localizzazione subcellulare delle proteine; le longine trovano inoltre un modello in VAMP7, Sec22b e Ykt6. Il LD adotta una conformazione chiusa che risulta stabile, ma non è ancora chiaro il contributo che tale conformazione e ogni differente dominio proteico portano alla determinazione della localizzazione stessa di tali proteine. VAMP7 umana, codificata dal gene SYBL1 è coinvolta in molteplici pathway subcellulari, compreso il controllo della crescita dei neuriti. Lo splicing alternativo nel locus di SYBL1 produce inoltre due famiglie di isoforme che mantengono un’interessante architettura di domini. Le longine non-SNARE condividono il dominio inibitorio LD, mentre le longine non-LD lo SNARE motif. Date le evidenze preliminari che conferiscono tale funzione inibitoria al costrutto artificiale LD e invece un’attività di promozione della crescita al costrutto non-LD, sembra plausibile che le due sottofamiglie rispecchino questi ruoli contrapposti. Tuttavia, i meccanismi coinvolti nella neuritogenesi non sono ancora completamente chiariti, soprattutto per quanto concerne il contributo degli stimoli extracellulari e delle diverse proteine SNARE. Questo lavoro di tesi si è incentrato sulla caratterizzazione del LD di VAMP7 e delle isoforme di splicing di questa proteina nell’ambito del loro ruolo sia nella localizzazione subcellulare, che nel differenziamento neuronale. Analisi di espressione in diversi tessuti e linee cellulari, dati quantitativi di real time RT-PCR e analisi di microscopia confocale hanno dimostrato come le varianti di VAMP7 presentino differenti tessuto-specificità e localizzazioni subcellulari; l’isoforma VAMP7i mostra inoltre una localizzazione anche nucleare. Considerando la loro diversa combinazione di domini, queste varianti di splicing fisiologiche sono state utilizzzate come strumenti per lo studio dei determinanti di localizzazione. Per di più, frammenti ricombinanti della regione citosolica di VAMP7a hanno confermato che i songoli domini non sono in grado da soli di determinare la localizzaione della proteina e che il cambiamento conformazionale aperto/chiuso non è rilevante per la localizzazione subcellulare, in assenza della regione trasmembrana. Esperimenti di gain-of-function su cellule di neuroblastoma e neuroni primari hanno mostrato l’esistenza di una regolazione della crescita dei neuriti mediata dallo splicing alternativo di VAMP7, con la produzione di isoforme sia inibitorie (VAMP7i) che stimolatorie (VAMP7dh). Tali effetti dipendono anche dal substrato (Poli-D-Lisina o Laminina) in cui i neuroni sono cresciuti e dalla co-espressione con altre isoforme di VAMP7 o con altre SNARE (VAMP2), indicando la presenza di un meccanismo di regolazione fine da parte dello splicing alternativo di VAMP7. Ulteriori investigazioni potranno portare sia alla manipolazione della neuritogenesi per scopi di terapeutici, sia al chiarimento del ruolo che le specifiche varianti di splicing possono avere in alcune malattie neurologiche. La futura caratterizzaione del LD di VAMP7 e delle sue isoforme, ad esempio il ruolo di VAMP7i nel nucleo possono definire nuovi interattori e meccanismi molecolari, utili in alcune applicazioni biotecnologiche.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Filippini, Francesco
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 24 > Scuole 24 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > BIOTECNOLOGIE
Data di deposito della tesi:31 Gennaio 2012
Anno di Pubblicazione:31 Gennaio 2012
Parole chiave (italiano / inglese):traffico subcellulare/subcellular trafficking, dominio longin/longin domain, VAMP7/VAMP7, differenziamento neuronale/neuronal differentiation, splicing alternativo/alternative splicing
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:4911
Depositato il:30 Ott 2012 14:22
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