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Sessolo, Michele (2012) Functional consequences of Familial Hemiplegic Migraine type 1 mutations on cortical activity. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

Missense mutations in the gene that encodes the pore-forming α1 subunit of voltage-gated CaV2.1 (P/Q-type) Ca2+ channels cause a rare autosomal dominant subtype of migraine with aura: Familial Hemiplegic Migraine type 1 (FHM1). Knock-in (KI) mice carrying FHM1 mutations show increased P/Q-type Ca2+ current density in central neurons including cortical pyramidal (PYR) cells (Tottene et al., 2009; van den Maagdenberg et al., 2004). The investigation of neurotransmission in neuronal microcultures and in acute cortical slices of R192Q FHM1 knock-in (KI) mice revealed increased strength of excitatory synaptic transmission due to increased action potential-evoked Ca2+ influx through presynaptic P/Q-type Ca2+ channels and increased probability of glutamate release at cortical PYR cell synapses of mutant mice; in striking contrast, inhibitory neurotransmission at connected pairs of fast-spiking interneurons and PYR cells was unaltered in FHM1 KI mice, despite being initiated by P/Q-type Ca2+ channels (Tottene et al., 2009). The finding of different effects of FHM1 mutation at different synapses suggests that episodic disruption of the excitation-inhibition balance may underlie the increased susceptibility to cortical spreading depression (CSD), the phenomenon underlying migraine aura and a likely trigger of the migraine headache mechanisms. To further test this hypothesis I focused on the effect of FHM1 mutations at other cortical synapses. To study the synaptic connections involving somatostatin-positive (SOM+) interneurons we took advantage of GIN (GFP-expressing Inhibitory Neurons) mice which express an enhanced GFP restricted to a subpopulation somatostatin-positive (SOM+) interneurons (GIN interneurons)(Oliva et al., 2000).
I performed double patch-clamp experiments on acute slices of somatosensory cortex to study excitatory and inhibitory synaptic transmission between layer 2/3 PYR cells and GIN interneurons in GIN mice. I have found that the excitatory synapse onto SOM+ interneurons shows short-term facilitation during trains of action potentials at 25 Hz suggesting that these interneurons can be recruited during sustained activity; in contrast, the inhibitory synapse between GIN interneurons and PYR cells displayed a relatively weak short-term depression during trains of action potentials at 20 Hz.
Since voltage-gated Ca2+ channels controlling neurotransmitter release at these synapses are not known I performed pharmacological experiments in the presence of the specific inhibitors of P/Q- (ω-Agatoxin IVA) and N-type (ω-Conotoxin GVIA) Ca2+ channels to determine the contribution of these Ca2+ channels in controlling neurotransmitter release. I found that both P/Q- and N-type Ca2+ channels contribute to control GABA release at the GIN interneuron synapses and glutamate release at the PYR cell synapses, with a predominant role of the P/Q-type Ca2+ channels. Given the important role of P/Q-type Ca2+ channels in controlling neurotransmitter release at these synapses it will be interesting to study excitatory and inhibitory neurotransmission between PYR cells and GIN interneurons in GIN mice carrying the R192Q FHM1 mutation.
To test the general hypothesis that FHM1 mutations might lead to an unbalance between inhibition and excitation towards excitation, I collaborated with Alessandra Fabbro in studying the total excitatory and inhibitory synaptic charge received by a layer 2/3 PYR cell during ongoing network activity without any type of stimulation. We performed voltage clamp recordings at the reversal potential for the inhibitory inputs (-79 mV) and at reversal potential for the excitatory inputs (+10 mV) to isolate spontaneous excitatory post-synaptic currents (sEPSC) and spontaneous inhibitory post-synaptic currents (sIPSCs) respectively.
Voltage-clamp recordings of sEPSCs and sIPSCs revealed two types of activity. The first is the spontaneous postsynaptic currents (sPSCs) which arise from uncorrelated and random spontaneous activity of presynaptic excitatory and inhibitory neurons which make synapses onto the patched cell; the second is characterized by high amplitude bursts of sPSCs which arise from correlated activity of a large population of presynaptic connected neurons generated through network mechanisms.
Integrals of the uncorrelated sPSCs in slices of WT and R192Q KI mice show that the excitatory synaptic charge of uncorrelated sEPSCs is larger in R192Q KI mice compared to WT mice, which is consistent with the enhanced glutamate release, and increased excitatory synaptic transmission found at PYR cells synapses of KI mice (Tottene et al, 2009). The inhibitory synaptic charge of uncorrelated sPSCs is not altered in KI mice which in accordance with unaltered inhibitory transmission at synapses of FS and other types of intemeurons contributing to the sIPSCs (Tottene et al, 2009).
The analysis of the large bursts of correlated sPSCs showed that both excitatory and inhibitory burst charge are increased in R192Q KI mice but the ratio of excitatory to inhibitory burst charges is similar in WT and KI mice. These findings indicate that during the spontaneous network activity the excitation-inhibition balance is not altered in R192Q KI mice. The increase of both excitatory and inhibitory burst charges in KI mice is caused by an increase of burst frequency. As a consequence, the fraction of time spent by the cortical network in the spontaneous synchronous activity is larger in KI than WT mice.

Abstract (italian)

L’emicrania emiplegica familiare di tipo 1 (FHM1), un raro sottotipo di emicrania con aura, è causata da mutazioni missenso nel gene che codifica per la subunità α1 dei canali del calcio (Ca2+) voltaggio dipendenti CaV2.1 (tipo P/Q).
I topi omozigoti knock-in (KI) recanti la mutazione FHM1 R192Q presentano, in granuli di cervelletto e in cellule piramidali corticali, un aumento della densità di corrente Ca2+ di tipo P/Q (Tottene et al., 2009; van den Maagdenberg et al., 2004). Lo studio della trasmissione sinaptica in microcolture neuronali e in fettine acute di cervello di topi KI ha dimostrato: un aumento della forza della trasmissione sinaptica eccitatoria dovuto ad un aumento dell’influsso di Ca2+ attraverso i canali di tipo P/Q localizzati a livello presinaptico e un aumento della probabilità di rilascio di glutammato alle sinapsi corticali di cellule piramidali (PYR) dei topi mutanti. Al contrario, la trasmissione sinaptica inibitoria studiata tra interneuroni fast-spiking (FS) e cellule PYR è risultata essere inalterata nei topi KI nonostante i canali di tipo P/Q siano coinvolti nel rilascio anche a queste sinapsi inibitorie (Tottene et al., 2009). Queste evidenze suggeriscono che alterazioni episodiche del bilancio tra eccitazione ed inibizione in corteccia possano essere alla base dell’aumentata suscettibilità alla cortical spreading depression (CSD, il fenomeno che sottende l’aura emicranica). Per confermare questa ipotesi mi sono concentrato sugli effetti delle mutazioni FHM1 ad altre sinapsi corticali. La connessione sinaptica tra cellule PYR ed interneuroni positivi alla somatostatina (SOM+) corrispondenti alle cellule di Martinotti in ratto, è stata studiata in topo sfruttando la disponibilità di un ceppo transgenico (GFP-expressing interneurons, GIN) che esprimono la GFP (green fluorescent protein) in una sottopopolazione di interneuroni positivi alla somatostatina per lo più considerati cellule di Martinotti (Oliva et al., 2000; Fanselow et al., 2008).
Ho eseguito esperimenti di doppio patch-clamp su fettine acute di cervello di corteccia somatosensoriale primaria per studiare la connessione eccitatoria tra cellule PYR e interneuroni SOM (da qui in poi chiamati interneuroni GIN) e la connessione inibitoria reciproca in topi GIN. Ho trovato che la connessione eccitatoria PYR-GIN presenta facilitazione a breve termine (short term facilitation) in risposta a treni di potenziali d’azione (action potentials, APs) a 25 Hz suggerendo che questi interneuroni possono essere reclutati da cellule PYR durante periodi di attività neuronale sostenuta; al contrario la sinapsi inibitoria GIN-PYR è caratterizzata da una debole depressione a breve termine (short term depression, STD) in risposta a treni di APs a 20 Hz.
I canali del Ca2+ che controllano il rilascio di neurotrasmettitore ad entrambe le sinapsi eccitatorie ed inibitorie tra cellule PYR ed inteneuroni GIN non sono noti; pertanto ho utilizzato un approccio farmacologico perfondendo nella soluzione extracellulare inibitori di specifici canali del Ca2+, ω-Agatoxin IVA per inibire i canali di tipo P/Q e ω-Conotoxin GVIA per inibire i canali di tipo N, per determinare il loro coinvolgimento nel controllo del rilascio di neurotrasmettitore. Questi esperimenti hanno evidenziato che i canali di tipo P/Q con un ruolo predominante e i canali di tipo N sono coinvolti e cooperano nel rilascio di neurotrasmettitore sia alla sinapsi eccitatoria PYR-GIN che a quella inibitoria GIN-PYR. Dato il coinvolgimento dei canali di tipo P/Q sarà interessante studiare eventuali alterazioni della trasmissione sinaptica eccitatoria ed inibitoria tra cellule PYR ed inteneuroni GIN in topi KI per la mutazione R192Q incrociati con i topi GIN.
Per verificare l’ipotesi generale che le mutazioni FHM1 possano portare ad uno sbilanciamento in corteccia tra inibizione ed eccitazione (a scapito di quest’ultima), ho collaborato con la Dott.ssa Alessandra Fabbro nello studio della carica sinaptica eccitatoria ed inibitoria totale che una cellula PYR dello strato 2/3 riceve durante l’attività di network in assenza di stimolazione. Abbiamo effettuato registrazioni di voltage clamp al potenziale di reversione degli input inibitori (-79 mV) e a quello degli input eccitatori (+ 10 mV) per poter isolare rispettivamente le correnti postsinaptiche eccitatorie (spontaneous excitatory postsynaptic currents, sEPSCs) e quelle inibitorie (spontaneous inhibitory postsynaptic currents, sIPSCs).
Gli esperimenti di voltage clamp hanno messo in evidenza due tipi di attività. La prima è caratterizzata da correnti postsinaptiche spontanee (spontaneous postsynaptic currents, sPSCs) generate da input non correlati, eccitatori o inibitori, che arrivano in modo casuale da cellule eccitatorie PYR ed interneuroni inibitori connessi con la cellula da cui si esegue la registrazione; il secondo tipo di attività è caratterizzato da burst di PSCs di grandi ampiezze e che originano dall’attività correlata, forse attraverso meccanismi di network, di grandi popolazioni di cellule eccitatorie o inibitorie che formano sinapsi sulla cellula registrata.
Il calcolo dell’integrale delle sPSCs non correlate in fette acute di corteccia somatosensoriale da topi WT e KI indicano che la carica eccitatoria delle sPESCs non correlate è aumentata nei topi KI in accordo con l’aumentato rilascio di glutammato e un aumentata trasmissione sinaptica eccitatoria alle sinapsi tra cellule PYR di topi KI (Tottene et al., 2009); al contrario la carica inibitoria mediata dalle sIPSCs non correlate risulta non essere alterata nei topi KI in accordo con l’inalterata trasmissione sinaptica inibitoria tra interneuroni FS e cellule PYR (Tottene et al., 2009).
L’analisi delle aree dei grandi burst di input correlati ha evidenziato che sia la carica eccitatoria che quella inibitoria dei burst sono aumentate nei topi KI ma il rapporto tra carica eccitatoria ed inibitoria risulta essere inalterata nei topi KI. Questi risultati indicano che durante l’attività spontanea di network il bilancio tra eccitazione ed inibizione non è alterato.
L’incremento della carica eccitatoria ed inibitoria nei topi KI è dovuto ad un aumento nella frequenza dei burst da cui consegue un aumento nel tempo trascorso dalla corteccia nell’attività spontanea correlata nei topi KI.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Pietrobon, Daniela
Ph.D. course:Ciclo 24 > Scuole 24 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > NEUROBIOLOGIA
Data di deposito della tesi:31 January 2012
Anno di Pubblicazione:31 January 2012
Key Words:FHM1, spontaneous synaptic, activity excitatory transmission, inhibitory transmission, GIN mice
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/09 Fisiologia
Struttura di riferimento:Dipartimenti > pre 2012 - Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali
Codice ID:4935
Depositato il:07 Nov 2012 11:58
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