Neurodegenerative disorders, such as Parkinson’s diseases (PD), are characterized by loss of specific neuronal populations and have been associated with mitochondrial dysfunction and oxidative stress. In addition, endoplasmic reticulum (ER) stress, a severe alteration in the structure and function of the ER with the accumulation of misfolded proteins and alterations in calcium homeostasis, has been suggested to be involved in some neuronal diseases. Finally, disturbed functions of the ubiquitin proteasome system (UPS), responsible for the degradation of cytosolic, ER, and synaptic proteins, is known to contribute to ER stress. The mechanisms through which these alterations impact on cell function are complex. Among them, however, the effect on the spatio-temporal patterns of a key second messenger, such as Ca2+, most likely plays a key role. My PhD program aimed at clarifying this important issue, focusing on simple pathogenetic models. Indeed, although most forms of PD are sporadic and multifactorial, an increasing number of mutations in specific genes were found in rare, genetic forms of the disease. Understanding the molecular pathogenesis of these forms may give important clues to the understanding of the more common sporadic cases, as well as provide some novel insight into the basic cell biology mechanisms. Specifically, mutations in a set of genes (alpha-synuclein, parkin and most recently in DJ-1, PINK1, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase-1, LRRK2/dardarin and Omi/HTRA2) have been associated with familial cases of PD. In all cases, the normal function of the gene products is not fully understood. Our aim was to study the role of these gene products in subcellular Ca2+ homeostasis, with major focus on mitochondria. Mitochondria play a central role in cell biology not only as producers of ATP, but also in the sequestration of Ca2+. Since they are the major site of free radical production in cells, they are also a primary target for oxidative damage and subsequent dysfunction. Mitochondria are also repositories of several proteins which regulates apoptosis. Perturbations in the normal functions of mitochondria will inevitably disturb cell function, may sensitise cells to neurotoxic insults and may initiate cell death. Alterations in mitochondrial Ca2+ signalling could synergize with mitochondrial dysfunction in causing deleterious functional alterations and committing the cell to death. In addition to the analysis of Ca2+ homeostasis, we have analysed other aspects of mitochondrial physiology including the energetic metabolism and the relationship between mitochondria and ER. Common interesting aspects are emerging from the data presented in this thesis, which have considered both the overexpression and the silencing of alpha-synuclein, parkin, DJ-1 and PINK1 proteins: all of them are able to modulate mitochondrial Ca2+ homeostasis. In particular alpha-synuclein, parkin, DJ-1 operate through the same mechanism by enhancing the ER-mitochondria contact sites of about 10%, thus enhancing the Ca2+ transfer between the two organelles. When this action is missing, as we have documented in the case of alpha-synuclein, the autophagic process can be activated. As for PINK1 we have identified an interesting biphasic effect. We have now to clarify whether this action could be related to distinct PINK1 distribution on mitochondrial membranes in respect to its expression levels and whether it may act by regulating the activity of the mitochondrial Ca2+ toolkit proteins. Experiments performed in permeabilized cells exposed to fixed 1 microM Ca2+ concentration account for this possibility.

Le malattie neurodegenerative, tra le quali il morbo di Parkinson (PD) sono associate a disfunzioni mitocondriali e a stress ossidativo. Inoltre, è stato suggerito che profonde alterazioni della struttura e delle funzioni del reticolo endoplasmatico (RE), una condizione nota come “ER stress”, e disfunzioni del sistema proteosoma-ubiquitina (UPS) siano alcuni dei processi cellulari coinvolti nell’insorgenza di queste malattie. I meccanismi attraverso i quali queste disfunzioni alterano la funzione cellulare sono complessi e solo parzialmente chiariti. Tra questi, gli effetti sulla distribuzione spazio-temporale di un secondo messaggero fondamentale per la corretta comunicazione cellulare, quale lo ione Ca2+, è sicuramente importante. Il programma del mio Dottorato di Ricerca prevedeva di chiarire alcuni di questi aspetti utilizzando modelli cellulari semplici. Infatti, anche se la maggior parte delle forme di PD sono sporadiche e multifattoriali, un numero crescente di mutazioni in geni specifici sono state individuate in alcune forme di malattia familiare. Lo studio delle funzioni delle proteine codificate da questi geni rappresenta quindi uno strumento molto importante per la comprensione degli aspetti molecolari alla base del processo neurodegenerativo. L’aspetto interessante è rappresentato dal fatto che le alterazioni cellulari alla base dei difetti genetici sono le stesse identificate nei casi sporadici. La delucidazione dei meccanismi patogenici delle forme genetiche, oltre a contribuire alla comprensione delle forme più diffuse, potrebbe quindi fornire anche nuove informazioni sui meccanismi cellulari alla base della insorgenza dei processi neurodegenerativi. In particolare, mutazioni in geni diversi (che codificano le proteine alfa-sinucleina, parkina, DJ-1, PINK1, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase-1 (UCHL-1), LRRK2/dardarina e Omi/HTRA2) sono state individuate in pazienti affetti da forme familiari di PD. In tutti i casi l’esatta funzione dei prodotti genici non è ancora completamente chiarita. Il programma di ricerca prevedeva di studiare il loro ruolo nella regolazione dell’omeostasi del Ca2+, con particolare attenzione alla funzione mitocondriale. Uno degli elementi comuni di molte malattie neurodegenerative è infatti rappresentato da disfunzioni del metabolismo mitocondriale del Ca2+. I mitocondri hanno un ruolo centrale nella biologia cellulare, non solo in quanto sono la sede principale di produzione di ATP, ma anche perché svolgono un ruolo importante nel sequestro del Ca2+ intracellulare e nella produzione di specie reattive dell’ossigeno e di radicali liberi. Essi sono il primo bersaglio del danno ossidativo e delle disfunzioni che ne derivano, inoltre contengono numerose proteine che regolano il fenomeno della morte cellulare per apoptosi. Perturbazioni della funzionalità mitocondriale portano quindi inevitabilmente a disturbi del funzionamento cellulare e possono dare origine al processo di morte cellulare rendendo le cellule più suscettibili agli insulti neurotossici. Oltre all’omeostasi mitocondriale del Ca2+ sono stati analizzati anche altri aspetti legati alla fisiologia mitocondriale, in particolare il metabolismo energetico e i rapporti tra mitocondri e RE. Dagli esperimenti presentati in questa tesi, che hanno analizzato sia gli effetti della sovraespressione che del silenziamento delle proteine alfa-sinucleina, parkina, DJ-1 e PINK1, emergono alcuni aspetti comuni molto interessanti: tutte queste proteine sono in grado di modulare l’omeostasi del Ca2+ mitocondriale. Per quanto riguarda alfa-sinucleina, parkina, DJ-1 abbiamo osservato che esse condividono anche il meccanismo con il quale operano questa modulazione: in tutti e tre i casi la loro sovraespressione provoca un aumento di circa il 10% dei contatti tra reticolo endoplasmatico e mitocondri e quindi potenzia il trasferimento di Ca2+ tra questi due organelli. Se questa funzione viene a mancare, come abbiamo dimostrato nel caso di alfa-sinucleina, viene attivata la risposta autofagica. Per quanto riguarda PINK1 abbiamo evidenziato la possibilità che possa regolare l’omeostasi mitocondriale del Ca2+ attraverso un’azione bifasica, resta da chiarire se ciò dipenda dalla sua distribuzione nelle membrane mitocondriali e dalla sua attività sulle proteine che regolano il trasporto del Ca2+ mitocondriale. Gli esperimenti condotti in cellule permeabilizzate, ed esposte ad una concentrazione di Ca2+ pari a 1 microM, sembrano suggerire questa possibilità.

Ruolo delle proteine alfa-sinucleina, parkina, DJ-1 e PINK1, mutate nelle forme familiari di Morbo di Parkinson, nel controllo dell'omeostasi mitocondriale dello ione Calcio / Ottolini, Denis. - (2012 Jan 31).

Ruolo delle proteine alfa-sinucleina, parkina, DJ-1 e PINK1, mutate nelle forme familiari di Morbo di Parkinson, nel controllo dell'omeostasi mitocondriale dello ione Calcio

Ottolini, Denis
2012

Abstract

Le malattie neurodegenerative, tra le quali il morbo di Parkinson (PD) sono associate a disfunzioni mitocondriali e a stress ossidativo. Inoltre, è stato suggerito che profonde alterazioni della struttura e delle funzioni del reticolo endoplasmatico (RE), una condizione nota come “ER stress”, e disfunzioni del sistema proteosoma-ubiquitina (UPS) siano alcuni dei processi cellulari coinvolti nell’insorgenza di queste malattie. I meccanismi attraverso i quali queste disfunzioni alterano la funzione cellulare sono complessi e solo parzialmente chiariti. Tra questi, gli effetti sulla distribuzione spazio-temporale di un secondo messaggero fondamentale per la corretta comunicazione cellulare, quale lo ione Ca2+, è sicuramente importante. Il programma del mio Dottorato di Ricerca prevedeva di chiarire alcuni di questi aspetti utilizzando modelli cellulari semplici. Infatti, anche se la maggior parte delle forme di PD sono sporadiche e multifattoriali, un numero crescente di mutazioni in geni specifici sono state individuate in alcune forme di malattia familiare. Lo studio delle funzioni delle proteine codificate da questi geni rappresenta quindi uno strumento molto importante per la comprensione degli aspetti molecolari alla base del processo neurodegenerativo. L’aspetto interessante è rappresentato dal fatto che le alterazioni cellulari alla base dei difetti genetici sono le stesse identificate nei casi sporadici. La delucidazione dei meccanismi patogenici delle forme genetiche, oltre a contribuire alla comprensione delle forme più diffuse, potrebbe quindi fornire anche nuove informazioni sui meccanismi cellulari alla base della insorgenza dei processi neurodegenerativi. In particolare, mutazioni in geni diversi (che codificano le proteine alfa-sinucleina, parkina, DJ-1, PINK1, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase-1 (UCHL-1), LRRK2/dardarina e Omi/HTRA2) sono state individuate in pazienti affetti da forme familiari di PD. In tutti i casi l’esatta funzione dei prodotti genici non è ancora completamente chiarita. Il programma di ricerca prevedeva di studiare il loro ruolo nella regolazione dell’omeostasi del Ca2+, con particolare attenzione alla funzione mitocondriale. Uno degli elementi comuni di molte malattie neurodegenerative è infatti rappresentato da disfunzioni del metabolismo mitocondriale del Ca2+. I mitocondri hanno un ruolo centrale nella biologia cellulare, non solo in quanto sono la sede principale di produzione di ATP, ma anche perché svolgono un ruolo importante nel sequestro del Ca2+ intracellulare e nella produzione di specie reattive dell’ossigeno e di radicali liberi. Essi sono il primo bersaglio del danno ossidativo e delle disfunzioni che ne derivano, inoltre contengono numerose proteine che regolano il fenomeno della morte cellulare per apoptosi. Perturbazioni della funzionalità mitocondriale portano quindi inevitabilmente a disturbi del funzionamento cellulare e possono dare origine al processo di morte cellulare rendendo le cellule più suscettibili agli insulti neurotossici. Oltre all’omeostasi mitocondriale del Ca2+ sono stati analizzati anche altri aspetti legati alla fisiologia mitocondriale, in particolare il metabolismo energetico e i rapporti tra mitocondri e RE. Dagli esperimenti presentati in questa tesi, che hanno analizzato sia gli effetti della sovraespressione che del silenziamento delle proteine alfa-sinucleina, parkina, DJ-1 e PINK1, emergono alcuni aspetti comuni molto interessanti: tutte queste proteine sono in grado di modulare l’omeostasi del Ca2+ mitocondriale. Per quanto riguarda alfa-sinucleina, parkina, DJ-1 abbiamo osservato che esse condividono anche il meccanismo con il quale operano questa modulazione: in tutti e tre i casi la loro sovraespressione provoca un aumento di circa il 10% dei contatti tra reticolo endoplasmatico e mitocondri e quindi potenzia il trasferimento di Ca2+ tra questi due organelli. Se questa funzione viene a mancare, come abbiamo dimostrato nel caso di alfa-sinucleina, viene attivata la risposta autofagica. Per quanto riguarda PINK1 abbiamo evidenziato la possibilità che possa regolare l’omeostasi mitocondriale del Ca2+ attraverso un’azione bifasica, resta da chiarire se ciò dipenda dalla sua distribuzione nelle membrane mitocondriali e dalla sua attività sulle proteine che regolano il trasporto del Ca2+ mitocondriale. Gli esperimenti condotti in cellule permeabilizzate, ed esposte ad una concentrazione di Ca2+ pari a 1 microM, sembrano suggerire questa possibilità.
31-gen-2012
Neurodegenerative disorders, such as Parkinson’s diseases (PD), are characterized by loss of specific neuronal populations and have been associated with mitochondrial dysfunction and oxidative stress. In addition, endoplasmic reticulum (ER) stress, a severe alteration in the structure and function of the ER with the accumulation of misfolded proteins and alterations in calcium homeostasis, has been suggested to be involved in some neuronal diseases. Finally, disturbed functions of the ubiquitin proteasome system (UPS), responsible for the degradation of cytosolic, ER, and synaptic proteins, is known to contribute to ER stress. The mechanisms through which these alterations impact on cell function are complex. Among them, however, the effect on the spatio-temporal patterns of a key second messenger, such as Ca2+, most likely plays a key role. My PhD program aimed at clarifying this important issue, focusing on simple pathogenetic models. Indeed, although most forms of PD are sporadic and multifactorial, an increasing number of mutations in specific genes were found in rare, genetic forms of the disease. Understanding the molecular pathogenesis of these forms may give important clues to the understanding of the more common sporadic cases, as well as provide some novel insight into the basic cell biology mechanisms. Specifically, mutations in a set of genes (alpha-synuclein, parkin and most recently in DJ-1, PINK1, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase-1, LRRK2/dardarin and Omi/HTRA2) have been associated with familial cases of PD. In all cases, the normal function of the gene products is not fully understood. Our aim was to study the role of these gene products in subcellular Ca2+ homeostasis, with major focus on mitochondria. Mitochondria play a central role in cell biology not only as producers of ATP, but also in the sequestration of Ca2+. Since they are the major site of free radical production in cells, they are also a primary target for oxidative damage and subsequent dysfunction. Mitochondria are also repositories of several proteins which regulates apoptosis. Perturbations in the normal functions of mitochondria will inevitably disturb cell function, may sensitise cells to neurotoxic insults and may initiate cell death. Alterations in mitochondrial Ca2+ signalling could synergize with mitochondrial dysfunction in causing deleterious functional alterations and committing the cell to death. In addition to the analysis of Ca2+ homeostasis, we have analysed other aspects of mitochondrial physiology including the energetic metabolism and the relationship between mitochondria and ER. Common interesting aspects are emerging from the data presented in this thesis, which have considered both the overexpression and the silencing of alpha-synuclein, parkin, DJ-1 and PINK1 proteins: all of them are able to modulate mitochondrial Ca2+ homeostasis. In particular alpha-synuclein, parkin, DJ-1 operate through the same mechanism by enhancing the ER-mitochondria contact sites of about 10%, thus enhancing the Ca2+ transfer between the two organelles. When this action is missing, as we have documented in the case of alpha-synuclein, the autophagic process can be activated. As for PINK1 we have identified an interesting biphasic effect. We have now to clarify whether this action could be related to distinct PINK1 distribution on mitochondrial membranes in respect to its expression levels and whether it may act by regulating the activity of the mitochondrial Ca2+ toolkit proteins. Experiments performed in permeabilized cells exposed to fixed 1 microM Ca2+ concentration account for this possibility.
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Ruolo delle proteine alfa-sinucleina, parkina, DJ-1 e PINK1, mutate nelle forme familiari di Morbo di Parkinson, nel controllo dell'omeostasi mitocondriale dello ione Calcio / Ottolini, Denis. - (2012 Jan 31).
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