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Santone, Melissa (2013) A new TLR2 agonist is able to promote cross-presentation. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

Cross-presentation is the process by which professional Antigen Presenting Cells (APCs) are able to load peptides from an extracellular processed protein into class I molecules, triggering a CD8+ T cells response. How to increase the efficiency of this process is thus an area of great interest for the development of antitumor and antiviral vaccines which are required to stimulate a cytotoxic T cell response. One promising strategy is the use of adjuvants, molecules that are added to vaccines in order to modulate the immune response and increase protection. The discovery that some compounds with adjuvant function are recognized by Toll like receptors (TLRs), receptors involved in pathogen-associated molecular patterns recognition, drove the interest in developing a novel family of vaccine adjuvant based on triggering the TLR pathways. The aim of my PhD project is to investigate if the novel compound, agonist of TLR2 (SMIP2-1), can enhance cross-presentation of soluble antigens to CD8+ T cells. SMIP2-1 is a novel synthetic lipopeptide, identified through two cell-based high throughput screens performed at the Genomic Institute of Novartis Research Foundation, and is currently under evaluation as vaccine adjuvant by Novartis Vaccines. Using mice reconstituted with Ovalbumin (OVA) specific OT-I TCR transgenic cells, as well as unreconstituted wild type mice, immunized with OVA and SMIP2.1, we found that addition of our compound to the vaccine formulation increases CD8+ T cell proliferation, cytokines production, and cytotoxic activity, along with specific antibody production. Moreover, using an OVA expressing tumor model, we show that the CTLs induced by the SMIP2.1 formulated vaccine are able to inhibit tumor growth in vivo. One mechanism by which SMIP2.1 could enhance the immunogenicity of antigens is its ability to increase antigen deposition in the draining lymph node of the site of injection, and the amount of APC that take up the antigen, as we demonstrated by confocal analysis. We then identified which cells populations can cross-present in vitro and we found that both CD8+ and CD8- DCs are able to cross-present when stimulated with SMIP2.1 In order to evaluate the effect of SMIP2.1 on human cells, we used a flow cytometry assay to detect activation of CD8+ T cells isolated from human PBMC of Cytomegalovirus seropositive donors. We found that stimulation with SMIP2.1 is able to greatly increase the capacity of human APC, pulsed in vitro with the pp65 CMV protein, to activate CMV-specific CD8+ T cells. Over all our data demonstrate that vaccination with exogenous antigen formulated with SMIP2.1 is a successful strategy to induce a cytotoxic T cell response along with antibody production.

Abstract (italian)

Si definisce “Cross-presentazione” il meccanismo attraverso il quale le Cellule Presentanti l’Antigene (APCs) sono capaci di catturare, processare e caricare sul complesso MHC di classe I peptidi derivanti da un antigene extracellulare, inducendo una risposta citotossica da parte dei linfociti T CD8+. La risposta citotossica è di particolare importanza per lo sviluppo di vaccini antitumorali e antivirali, per i quali è necessaria un’attivazione delle cellule T CD8+. Come indurre la cross-presentazione ha quindi stimolato grande interesse da parte delle industrie farmaceutiche per lo sviluppo di questi vaccini. Una strategia promettente è l’utilizzo di adiuvanti, molecole aggiunte ai vaccini per modulare la risposta immunitaria e aumentare la protezione. La scoperta che composti con funzioni adiuvanti legassero i recettori di tipo Toll (TLRs), recettori coinvolti nel riconoscimento di motivi molecolari comuni a molti microrganismi patogeni, ha sollevato l’interesse verso lo sviluppo di una nuova famiglia di adiuvanti basati sull’attivazione dei pathways dei TLRs. Lo scopo del mio progetto di Dottorato è investigare se un nuovo composto, agonista del TLR2 (SMIP2.1), può aumentare la cross-presentazione di un antigene esogeno alle cellule T CD8+. SMIP2-1 è un lipopeptide di sintesi, identificato attraverso uno screening effettuato al Genomic Institute of Novartis Research Foundation, che Novartis Vaccines intende utilizzare come adiuvante. Utilizzando Ovalbumina (OVA) come antigene esogeno, abbiamo osservato che l’immunizzazione con OVA + SMIP2.1, sia di topi transgenici con un TCR specifico per OVA che di topi wild type, aumenta la risposta T CD8+ in termini di proliferazione, produzione di citochine e attività citotossica, rispetto a topi vaccinati solo con l’antigene. Inoltre, SMIP2.1 induce un’ottima risposta anticorpale contro l’antigene, caratteristica fondamentale di un adiuvante. Utilizzando cellule tumorali murine che esprimono OVA, abbiamo osservato che la risposta citotossica indotta dall’agonista del TLR2 è capace di inibire la crescita tumorale in vivo. Un meccanismo attraverso cui SMIP2.1 aumenta la risposta immunitaria potrebbe essere la sua abilità di aumentare la deposizione dell’antigene nei linfonodi drenanti sul sito di iniezione e l’uptake dell’antigene da parte delle APCs, come dimostrato dalle osservazioni al microscopio confocale. Abbiamo poi analizzato quale popolazione cellulare può cross-presentare in vitro, scoprendo che sia le cellule dendritiche CD8+ e CD8- sono capaci di cross-presentare dopo stimolazione con SMIP2.1.
Per valutare l’effetto dell’agonista del TLR2 su cellule umane, abbiamo usato un’analisi al citofluorimetro per misurare l’attivazione delle cellule T CD8+ isolate dai PBMC di pazienti positivi per il Citomegalovirus. Abbiamo trovato che SMIP2.1 aumenta la capacità delle APC umane, stimolate in vitro con la proteina pp65 del CMV, di attivare una popolazione T CD8+ specifica per il CMV.
In conclusione, i nostri dati dimostrano che la vaccinazione con una proteina esogena formulata con SMIP2.1 è una promettente strategia per indurre sia una risposta citotossica che una risposta anticorpale.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Montecucco, Cesare and Buonsanti, Cecilia
Ph.D. course:Ciclo 25 > Scuole 25 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > BIOLOGIA CELLULARE
Data di deposito della tesi:22 January 2013
Anno di Pubblicazione:22 January 2013
Key Words:cross-presentation/ adjuvants/ TLR2/ vaccine
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:5406
Depositato il:11 Oct 2013 13:01
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