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Rai, Amit Kumar (2013) Proteomic and immunofluorescence studies of ectopic F0F1 ATP synthase: a novel pharmacological target of HDL endocytosis in liver. [Tesi di dottorato]

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Documento PDF (PhD Thesis) - Versione preliminare (Draft)
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Abstract (inglese)

Abstract
Over the past few years, several reports have described the presence of F0F1 ATP synthase subunits and it’s inhibitor IF1 at the cell surface of various cells with the catalytic F1 sector facing outside. The enzyme, called ectopic ATPase/synthase, was found to mediate various biological functions such as HDL endocytosis, transmembrane pH regulation, tumor cell recognition. An intriguing question is whether the ectopic enzyme has the same subunit composition and molecular mass as that of the mitochondrial ATP synthase. Another question is its localization in plasma membrane, especially in hepatocytes due to their polar nature, where the enzyme mediates HDL endocytosis. Using different methods to prepare rat liver plasma membranes, which have been subjected to digitonin extraction, hr CNE,
immunoblotting, immunoprecipitation and mass spectrometry, the presence of ectopic F0F1 complexes with a similar molecular weight to the monomeric form of the mitochondrial complexes was demonstrated. Moreover, these complexes contained both nuclear and mitochondrially-encoded subunits, making it unlikely that the enzyme is assembled on the plasma membranes, while suggesting it to be transported after being assembled in mitochondria by still unknown pathways. Moreover, the plasma membrane preparation enriched in basolateral proteins contained much higher amounts of complete and active F0F1
complexes, suggesting their localization on this cellular pole, which was consistent with their specific function to modulate HDL uptake on hepatocyte surface.
Immunofluorescence studies allowed to demonstrate that the ecto-F0F1 complexes were localized in lipid rafts of plasma membrane on the HeLa cells. Only in non-permeabilized cells IF1 co-localized with the F0F1 ATP synthase β-subunit and flotillin, a lipid raft marker. In accordance, the OSCP subunit (oligomycin sensitivity conferring protein) was also found to pair with the β-subunit and IF1, suggesting the presence of a
functional–although small mitochondria-like organization on the cell surface of HeLa cells.
Notably, cholesterol loading in HeLa cells, performed at different time intervals, reduced the mitochondrial content of IF1, with a parallel increase of its ectopic expression. The higher surface expression of IF1 could therefore represent a mechanism to preserve ATP level on the extra cellular space sparing this from the F0F1 ATPase mediated hydrolysis. In conclusion, our studies both at tissue and cellular level demonstrate the existence of
complete and functional ectopic F0F1 ATP synthase displaying a similar molecular weight as that of mitochondrial complex.

Abstract (italiano)

Astratto
Negli ultimi anni, diversi studi hanno descritto la presenza di subunità F0F1 ATP sintasi ed è inibitore IF1 sulla superficie cellulare di cellule diverse con il settore catalitico F1 rivolta verso l'esterno. L'enzima, chiamato ectopica ATPasi / sintasi, è stato trovato per mediare varie funzioni biologiche quali endocitosi HDL, regolazione pH transmembrana, riconoscimento della cellula tumorale. Una domanda interessante è se l'enzima ectopica ha la stessa composizione subunità e massa molecolare come quello della sintasi mitocondriale ATP. Un'altra questione è la sua localizzazione in membrana plasmatica, soprattutto in epatociti causa della loro natura polare, in cui l'enzima HDL media endocitosi. Utilizzando diversi metodi per preparare membrane plasmatiche di fegato di ratto, che sono stati sottoposti ad estrazione digitonina, hr CNE, immunoblotting, immunoprecipitazione e spettrometria di massa, la presenza di ectopici F0F1 complessi con un peso molecolare simile alla forma monomerica dei complessi mitocondriali è stato dimostrato. Inoltre, questi complessi contenevano entrambe le subunità nucleari e mitocondrialmente-codificato, rendendo improbabile che l'enzima è montato sulle membrane plasmatiche, mentre suggerendo che per essere trasportato dopo essere stato assemblato in mitocondri percorsi ancora sconosciuti. Inoltre, la preparazione della membrana plasmatica arricchita in proteine basolaterali conteneva quantità più elevate di completi e attiva F0F1 complessi, suggerendo loro localizzazione sul palo cellulare, che è coerente con la specifica funzione di modulare l'assorbimento HDL sulla superficie degli epatociti.
Studi di immunofluorescenza ha permesso di dimostrare che i F0F1 ectoparassiti complessi sono stati localizzati in lipid rafts di membrana plasmatica sulle cellule HeLa. Solo in cellule non
permeabilizzate IF1 co-localizzato con il F0F1 ATP sintasi β-subunità e flotillina, un marker zattera lipidica. Secondo, la subunità OSCP (sensibilità oligomicina conferisce proteina) è stato trovato anche l'associazione con il β-subunità e IF1, suggerendo la presenza di un funzionale, anche se piccolo mitocondri simile organizzazione sulla superficie cellulare di cellule HeLa. In particolare, il carico di colesterolo nelle cellule HeLa, eseguita a intervalli di tempo differenti, ridotto il contenuto mitocondriale di IF1, con un parallelo aumento della sua espressione ectopica. L'espressione più alta di superficie IF1 potrebbe quindi rappresentare un meccanismo per mantenere il livello di ATP nello spazio extracellulare risparmiando questo dalla idrolisi mediata F0F1 ATPasi. In conclusione, i nostri studi sia a livello cellulare e tissutale dimostrare l'esistenza di completo e funzionale ectopica F0F1 ATP sintasi visualizzando un peso molecolare simile a quella del complesso mitocondriale.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Dabbeni-Sala, Federica
Correlatore:Lippe, Giovanna - Campanella, Michelangelo
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 25 > Scuole 25 > SCIENZE FARMACOLOGICHE > FARMACOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Data di deposito della tesi:28 Gennaio 2013
Anno di Pubblicazione:28 Gennaio 2013
Parole chiave (italiano / inglese):mitochondria, plasma membrane, ectopic ATP synthase, hr CN PAGE, HDL endocytosis
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/14 Farmacologia
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze del Farmaco
Codice ID:5568
Depositato il:23 Ott 2013 10:15
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