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Sosic, A (2013) Two perspectives to consider Nucleic Acids. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

Since their discovery, nucleic acids have been the object of intense and thorough explorations, leading to the understanding of their structure and functions. Their role as genetic information carriers is well known but there are evidences that they are also involved in a series of other less known processes. No longer have nucleic acids to be considered passive structures, but they are dynamic and active macromolecules, able to assume a number of three-dimensional conformations. Precisely, the conformation of nucleic acids, encoded in their primary sequence, is the component that determines the specific and selective interaction with a biological target.
This work is essentially divided in two parts reflecting the dual nature of nucleic acids and aimed at developing two different projects, one where nucleic acids represent a valid target for new potential therapeutic agents and the other where nucleic acids, playing an active role in the protein recognition, are developed as diagnostic agents.
The first part of my PhD research activity is included in a wider project aimed to identify potential antiviral agents able to interfere with the NC chaperone activity. NC has multiple functions during the HIV-1 replication cycle and, in particular, the chaperone activity of NC is critical in reverse transcription. The recombinant full-length NC protein and its biological activity were deeply characterized: the analysis of the NC structure was completed by circular dichroic spectroscopy (CD). Then, the chaperone activity of NC i.e. its ability to destabilize the secondary structures of the viral nucleic acids TAR and cTAR was evaluated by a Fluorescence Assay and a FRET assay; NC aggregating activity was instead monitored through gel electrophoresis that allowed us to analyze the TAR/cTAR annealing reaction in the presence of the full-length NC protein.
The effect of compounds on the chaperone activity of NC was investigated: to achieve this goal, a simple, fast and highly reproducible FRET-based assay for the High Throughput Screening (HTS) of inhibitors of the NC nucleic acids destabilization activity was optimized. A wide range of small molecules with different chemical structures from our in-house chemical library were analyzed, and in this work we focus on molecules with intercalating ability.
2,6-dipeptidyl anthraquinones, known DNA and RNA binders, were analysed as potential NC inhibitors: they could interfere with NC chaperone activity thanks to their attitude of stabilize the secondary structures of RNA and DNA sequences involved in the retrotranscription process. The effect of anthraquinones (series Z, GSF and G) on the chaperone activity of NC was investigated by HTS and the IC50 values on TAR and cTAR were determined for each compound. All tested anthraquinones are active both toward TAR and cTAR: the proposed mechanism of action for anthraquinones was therefore studied in more details by Melting Assays (FRET probes coupled to thermal melting experiments). We analyzed the ability of each compound to bind and stabilize the secondary structure of cTAR, TAR and of the TAR/cTAR hybrid. Melting Assay data supported HTS results, since the most active inhibitors of the chaperone NC activity resulted to be also strong TAR and cTAR stabilizers. Finally, we analyzed by native gel electrophoresis the effect of the most promising anthraquinones on the NC-mediated annealing of TAR with cTAR, to verify the effectiveness of the inhibition of the NC chaperone activity during the step subsequent to TAR and cTAR melting. All the tested anthraquinones resulted to be inhibitors of the TAR/cTAR hybrid formation, according with the NC inhibitory activity analyzed by HTS. Hence, viral nucleic acids involved in reverse transcription represent a new validated target for anti-HIV drugs design and 2,6-dipeptydil anthraquinones were identified as highly active anti-NC compounds which could be further analyzed to be developed as new potential antiviral agents.
Moreover, a promising class of anti-HIV agents is represented by compounds which interfere with the Tat-mediated transcription process of the viral replicative cycle. Two classes of compounds were studied as inhibitors of the Tat-TAR complex formation. Quinolones are a promising class of anti-HIV compounds which interfere with the Tat mediated transcription process. To provide new insights into the SAR of antiviral quinolones, WP and HP series were analyzed by Fluorescence Quanching Assay (FQA), a FRET-based platform of screening that allowed the determination of the inhibition constant Ki for each compound. All the tested 6-DFQs of WP series are active as Tat-TAR complex formation inhibitors, with Ki values lower than the control WM5. WP series differs from the control for modifications introduced at the N1 position: these modifications do not result in loss of activity, but rather seem to improve the activity of WP quinolones as inhibitors of the Tat-TAR complex formation. The second class of compounds tested as inhibitors of the Tat-TAR complex formation was constituted by ellagic acid and some synthetic bi- and mono-lactones derivatives. ELs analysis was not possible to be performed by FQA due to a quenching effect observing after the addition of ELs to fluoresceinated Tat. The analysis of the ELs interference on the Tat-TAR complex was therefore performed by EMSA. Compound 1186 can act as Tat-TAR complex formation inhibitor and therefore supports the potential anti-HIV activity of ELs.
The second part of my research work is focused on the development, optimization and characterization of a novel sensing system with therapeutic and diagnostic interest employing nucleic acids aptamers for the detection of proteins involved in diverse diseases. Biosensors based on the use of aptamers for specific recognition of an analyte are called "aptasensors". We developed the Sandwich Aptamer Microarray (SAM) with the aim to replace the traditional immunochemical systems used as diagnostics. SAM is a system ELISA-like, using a similar architecture, but totally based on aptamer technology with a "primary aptamer" as selection element and a "secondary aptamer" as a signal transducer. Two DNA aptamers with distinct protein recognition patterns are used in tandem for the simultaneous recognition of the target protein.
We developed an aptamer-based microarray for human thrombin detection exploiting two non-overlapping DNA thrombin binding aptamers recognizing different exosites of the target protein. The 15-mer aptamer (TBA1) binds the fibrinogen-binding site, whereas the 29-mer aptamer (TBA2) binds the heparin binding domain. Appropriate chemical modifications were introduced in primary and secondary aptamers to adapt them to the format design and to the detection technology. Extensive analysis on the complex formation between human thrombin and modified aptamers was performed by EMSA, in order to verify in solution whether the chemical modifications introduced would affect aptamers/protein recognition. The validated system was then applied to the aptamer microarray, using the solid phase system devised by the solution studies. Our SAM system based on aptamer recognition of an analyte resulted to be efficient and specific, and different detection aptamers and methods can be utilized. The use of the indirect method (TBA2- biotin plus Cy3-streptavidin) allows lower LOD and LOQ when compared to TBA2-Cy5 (direct method) even in the presence of biological fluids. SAM exhibits a limit of detection comparable to other systems described in the literature employing the same aptamers and different technologies but has the advantage of a simple set up.
In view of future applications of SAM in multiplex microarray systems, we enlarged the SAM system analysis on the VEGF165 detection using two anti-VEGF165 aptamers that recognize different sites of the protein. Following the same approach adopted for thrombin, a deep analysis and optimization of binary and ternary complexes formation between the modified anti-VEGF165 aptamers and VEGF165 in solution was performed prior to verify the sandwich aptamer formation in solid phase. The sandwich aptamer formation was verified also for VEGF165. This pioneering work suggests that SAM, developed for thrombin and VEGF165 detection, could represent a useful tool to monitor protein concentration in blood or plasma and represents a potential application of aptamers in diagnostic.

Abstract (italian)

Dal giorno della loro scoperta, più di un secolo fa, gli acidi nucleici sono stati analizzati e studiati approfonditamente in tutti i loro aspetti, cercando di svelare gli ancora numerosi segreti nascosti nella loro struttura per comprenderne appieno le funzioni. Il ruolo più comunemente associato ad essi è sicuramente quello di trasportatori dell’informazione genetica ma numerose evidenze sperimentali ne confermano il coinvolgimento in una serie di altri processi meno noti. Gli acidi nucleici non devono perciò essere concepiti come strutture rigide e passive, ma come molecole dinamiche e attive, in grado di assumere numerose strutture tridimensionali. È proprio la conformazione spaziale che assumono gli acidi nucleici, codificata nella loro sequenza nucleotidica, che determina l’interazione specifica e selettiva con un bersaglio molecolare.
Questo lavoro è essenzialmente diviso in due parti ed è finalizzato alla comprensione della duplice natura degli acidi nucleici, sviluppando due aspetti differenti ma complementari legati ad essi. Essendo correlati a numerosi eventi cellulari, gli acidi nucleici rappresentano un ottimo target per lo sviluppo di nuovi farmaci e allo stesso tempo, svolgendo un ruolo attivo nel riconoscimento di elementi proteici, gli acidi nucleici possono essere sviluppati come agenti diagnostici.
La prima parte del mio lavoro di dottorato fa parte di un ampio progetto volto a identificare potenziali agenti antivirali, la cui azione può essere ricondotta all’inibizione dell’attività di NC mediante l’interazione diretta con il DNA e l’RNA virali. NC svolge numerose funzioni durante il ciclo replicativo di HIV-1 ed in particolare, grazie all’attività di chaperone, promuove varie reazioni di annealing nel processo di retrotrascrizione. Piccole molecole che siano in grado di riconoscere gli acidi nucleici virali coinvolti in questi passaggi possono essere considerati potenziali inibitori del ciclo replicativo di HIV-1, poiché in grado di interferire con l’attività di NC. La proteina ricombinante NC, full-length, e la sua attività biologica sono state caratterizzate: l'analisi della struttura di NC è stata completata mediante dicroismo circolare (CD). L'attività chaperonica di NC cioè la sua capacità di destabilizzare le strutture secondarie di TAR e cTAR è stata valutata utilizzando un saggio di fluorescenza e un saggio FRET; l’attività aggregante di NC è stata invece monitorata attraverso gel elettroforesi e ci ha permesso di analizzare la reazione di formazione dell’ibrido TAR/cTAR in presenza della proteina NC. È stata quindi studiata la capacità di composti di interferire sull’attività chaperonica di NC: è stato ottimizzato un saggio FRET che è risultato semplice, veloce e altamente riproducibile per l’High Throughput Screening (HTS) di inibitori di NC. È stato possibile analizzare più di cento composti appartenenti a famiglie chimiche molto diverse, ma in questo lavoro ci siamo concentrati su piccole molecole con attività intercalante.
Gli antrachinoni 2,6-dipeptidil sostituiti, noti leganti di DNA e RNA, sono stati analizzati come potenziali inibitori di NC: essi potrebbero interferire con l’attività chaperonica di NC stabilizzando le strutture secondarie di DNA e RNA coinvolte nel processo di retrotrascrizione. Gli antrachinoni delle serie Z, GSF e G sono stati analizzati mediante HTS e i valori di IC50 nei confronti di TAR e cTAR sono stati determinati per ciascun composto. Tutti gli antrachinoni testati sono attivi sia su TAR che su cTAR: il meccanismo d’azione proposto per questi composti è stato quindi approfondito mediante saggi di Melting (sonde FRET accoppiate ad esperimenti di melting). Abbiamo analizzato la capacità di ciascun composto di legare e stabilizzare le strutture secondarie rispettivamente di TAR, cTAR e dell’ibrido TAR/cTAR. I risultati ottenuti mediante saggi di Melting supportano i risultati ottenuti mediante HTS, poiché i composti maggiormente attivi come inibitori di NC sono risultati anche dei potenti stabilizzanti di TAR e cTAR. Infine, abbiamo analizzato, mediante gel elettroforesi, l’effetto degli antrachinoni più promettenti sulla reazione di formazione dell’ibrido mediata da NC, per confermare la correlazione tra inibizione dell’attività chaperonica di NC e l’immediatamente successiva formazione dell’ibrido. Tutti gli antrachinoni testati sono risultati inibitori della formazione dell’ibrido TAR/cTAR, in accordo con i risultati di HTS. Quindi, acidi nucleici virali coinvolti nella retrotrascrizione rappresentano un nuovo e validato bersaglio per lo sviluppo di farmaci anti-HIV e gli antrachinoni 2,6-dipeptidil sostituiti sono stati identificati come composti attivi anti-NC che potrebbero essere sviluppati come potenziali agenti antivirali.
Inoltre, una promettente classe di potenziali anti-HIV è rappresentata da composti che interferiscono con il processo di trascrizione, Tat-mediato, del ciclo replicativo virale. Due classi di composti sono state studiate come inibitori della formazione del complesso Tat-TAR. I chinoloni sono una nota classe di farmaci anti-HIV che interferiscono con il processo di trascrizione mediata da Tat. Per fornire nuove informazioni SAR (Structure-Activity Relationship) sui chinoloni antivirali, le serie WP e HP sono state analizzate mediante test di Fluorescence Quanching (FQA), una piattaforma di screening basata su saggi FRET che ha permesso la determinazione della costante di inibizione Ki per ciascun composto. Tutti i 6-DFQs della serie WP testati sono attivi come inibitori della formazione del complesso Tat-TAR, con valori di Ki inferiori rispetto al controllo WM5. La serie WP differenzia dal controllo per modifiche introdotte nella posizione N1: tali modifiche sembrano migliorare l'attività dei chinoloni WP come inibitori Tat-TAR. La seconda classe di composti testati come inibitori Tat-TAR è costituita da acido ellagico e alcuni derivati sintetici bi-e mono-lattoni (ELs). Non è stato possibile analizzare gli ELs mediante FQA, e l’analisi è stata quindi eseguita mediante EMSA. Il composto 1186 è un buon inibitore della formazione del complesso Tat-TAR e questo risultato perciò supporta l’ipotesi di sviluppare gli ellagici come potenziali antivirali.
La seconda parte del mio lavoro di ricerca è focalizzata sull'ottimizzazione, sviluppo e caratterizzazione di un nuovo sistema sensoristico per la rilevazione di proteine coinvolte in malattie, con interesse diagnostico e terapeutico. Biosensori basati sull'uso di aptameri per il riconoscimento specifico di un analita sono chiamati "aptasensori". Abbiamo sviluppato un Sandwich Aptamer Microarray (SAM) con lo scopo di sostituire i tradizionali sistemi immunochimici utilizzati in diagnostica. SAM è un sistema simil-ELISA, che usa un'architettura simile, ma è totalmente basato sulla tecnologia degli aptameri: un "aptamero primario" è utilizzato come elemento di selezione e un "aptamero secondario" come trasduttore del segnale. Aptameri di DNA che riconoscono differenti esositi della proteina target vengono utilizzati in tandem per il riconoscimento simultaneo della proteina bersaglio.
Il primo target proteico è costituito dalla trombina. Sono noti e ben caratterizzati due aptameri di DNA che legano la trombina in esositi diversi: TBA1 lega il sito di riconoscimento del fibrinogeno, mentre TBA2 lega la trombina a livello del sito di riconoscimento dell’eparina. Gli aptameri sono stati opportunamente modificati per l’ancoraggio alla superficie solida e per la rilevazione del segnale di fluorescenza. Un’analisi estensiva in soluzione della formazione dei complessi binari e ternari aptameri-proteina è stata effettuata mediante EMSA, per verificare se in soluzione le modifiche chimiche introdotte compromettono il riconoscimento della proteina da parte degli aptameri. Poi, è stata verificata la formazione del sandwich in fase solida. SAM è risultato efficace e specifico, e diversi aptameri secondari e diversi metodi di rilevazione possono essere utilizzati. L'utilizzo del metodo indiretto (TBA2-biotina più streptavidina-Cy3) permette di raggiungere LOD e LOQ inferiori rispetto a TBA2-Cy5 (metodo diretto) anche in presenza di fluidi biologici.
Il secondo target proteico che è stato utilizzato è il VEGF165: due aptameri di DNA anti-VEGF sono stati recentemente selezionati. Seguendo lo stesso approccio adottato per la trombina, la coppia di aptameri modificati che assicura la formazione a sandwich è stata identificata in soluzione e il sistema è stato poi applicato in fase solida. I risultati ottenuti sono positivi e coerenti con i risultati ottenuti dall'analisi in soluzione. SAM, sviluppato per la detection della trombina e del VEGF, rappresenta un potenziale mezzo per monitorare i livelli di proteina nel plasma o nel sangue e dimostra quindi la potenzialità dell’uso degli aptameri in campo clinico e diagnostico.

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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Gatto, B
Ph.D. course:Ciclo 25 > Scuole 25 > SCIENZE MOLECOLARI > SCIENZE FARMACEUTICHE
Data di deposito della tesi:30 January 2013
Anno di Pubblicazione:31 January 2013
Key Words:nucleic acids, anti-HIV, aptamer, microarray
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 03 - Scienze chimiche > CHIM/08 Chimica farmaceutica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze del Farmaco
Codice ID:5830
Depositato il:11 Oct 2013 15:21
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