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Frenati, Melania (2013) Role of CYBR, a cytohesin binder and regulator scaffold protein, in cell-mediated immune response in vivo. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Cybr (Cytohesin binder and regulator) is an adaptor protein involved in the assembly and recruitment of protein complexes associated with intracellular trafficking and signaling. Cybr has attracted attention as a potential key contributor to molecular mechanisms governing cells of the immune system due to its exclusive expression in cells of hematopoietic origin. Cybr interacts with members of the ADP ribosylation factor (ARF)-activating cytohesin family, mainly cytohesin-1, and it is involved in the cytohesin-1-mediated adhesion of LFA-1 to ICAM-1. Cybr expression is highly and rapidly responsive to, and regulated by, many cytokines and other soluble effectors of the immune system suggesting a potential functional role in the vesicle formation, endocytic trafficking, regulation of TCR signalling and regulation of dendritic cell (DC)/T cell interaction during the antigen presentation. To characterize the in vivo physiological role of this molecule, a Cybr-deficient mouse strain was created. Cybr deletion does not profoundly affect the development of the immune system, but Cybr-KO mice display a reduced or delayed capacity to respond to different stimuli and in stress conditions.
This project aimed at investigating the biological function of Cybr in cell-mediated immune response to tumors induced by the retroviral complex constituted by the Moloney murine sarcoma virus/Moloney murine leukemia virus (M-MSV/MuLV, hereafter indicated as M-MSV). Intramuscular injection of M-MSV in immunocompetent C57BL/6 (B6) mice causes sarcomas that spontaneously regress because of a strong immune reaction primarily mediated by cytotoxic T lymphocytes (CTL) specific for viral antigens. Conversely, Cybr-deficient mice injected with M-MSV developed larger tumors than B6 mice, which additionally regressed with a slower kinetics. To disclose the biological bases of this behavior, M-MSV-injected Cybr-deficient and wild type mice were characterized for the lymphocyte phenotype and function in tumors, lymph nodes and spleens at the peak of tumor growth (day 11 to 15). We found a reduced number of CD4+ and CD8+ T cells, as well as of antigen-specific CTL, in the tumor infiltrating cells (TIL) of Cybr-deficient mice. However, this defect was recovered after a short temporal shift.
Similarly, a three-day delay was also reported in the onset of lytic activity in Cybr-deficient respect to wild type CTLs. On the contrary, wild type or Cybr-deficient memory T cells from tumor regressor mice did not show any difference in terms of lytic activity. Overall, these data indicate that Cybr deficiency has a significant impact on the activation of naive T cells and expansion of primed T cells, but do not clarify whether Cybr mostly influence priming and/or cell adhesion or trafficking and migration of immune system cells. To address this issue, we transferred naive Cybr-KO or wild type GFP T cells in tumor-bearing RAG2-/- γc-/- mice, that lack T, B and NK cells and do not spontaneously regress M-MSV-induced tumors. Despite T cell transfer, tumors continued to growth indicating that transferred naive T cells were not able to mount a fully effective immune response in this setting. This was probably due to a suboptimal recruitment and priming phase in lymph nodes, that were found to be hypoplastic. To provide a mechanistic insight, reconstitution of nu/nu athymic B6 mice with T cell-depleted bone marrow from either wild type or Cybr-KO mice, followed by adoptive transfer of naive or memory T cells from Cybr-KO/GFP or B6/GFP animals, will provide the appropriate experimental set up to assess the role of Cybr in the APC or T cell compartments.
Taken together, outlined results indicate that Cybr deficiency has a significant impact on antigen-specific immune response, but further studies have to be performed to fully dissect the role played by this molecule in the priming phase and in the delayed onset of lytic activity

Abstract (italiano)

Cybr (cytohesin binder and regulator) è una proteina adattatrice coinvolta nell’assemblaggio e nel reclutamento di complessi proteici associati con il trafficking intracellulare e la trasduzione del segnale. Grazie alla sua esclusiva espressione in cellule di origine ematopoietica, Cybr ha attirato l’attenzione come potenziale proteina chiave nei meccanismi molecolari che controllano le cellule del sistema immunitario. Cybr interagisce con i membri della famiglia delle citoesine attivanti gli ADP ribosylation factors (ARF), specialmente con citoesina-1, e regola l’adesione citoesina-1 mediata di LFA 1 a ICAM-1. La sua espressione è rapidamente regolata da molte citochine e da altri effettori solubili del sistema immunitario. Alcuni ruoli funzionali proposti per questa molecola sono la partecipazione nella formazione delle vescicole, nel trafficking endocitico, nella regolazione del signaling del TCR e nell’interazione tra cellule dendritiche e cellule T durante la presentazione dell’antigene. Al fine di caratterizzare il ruolo fisiologico di questa molecola in vivo, è stato creato un ceppo di topi deficienti per Cybr. Questi topi, nonostante un normale sviluppo del sistema immunitario, mostrano una ridotta o ritardata capacità di rispondere a diversi stimoli e in condizioni di stress.
Questo progetto di ricerca si è prefisso di investigare la funzione biologica di Cybr nella risposta immunitaria cellulo-mediata nei confronti di tumori indotti dal complesso retrovirale costituito dai virus sarcomatogeno e leucemogeno murini di Moloney (M-MSV/MuLV, in seguito indicato come M-MSV). L’inoculo intramuscolare di M-MSV in topi C57BL/6 (B6) immunocompetenti causa lo sviluppo di sarcomi che regrediscono spontaneamente grazie ad una forte risposta immunitaria mediata principalmente da linfociti T citotossici (CTL) specifici per gli antigeni virali. Al contrario, topi Cybr-deficienti inoculati con M-MSV sviluppano tumori di dimensioni maggiori e che regrediscono più lentamente rispetto ai controlli. Per comprendere i motivi di questo diverso andamento, dopo l’inoculo del complesso retrovirale in topi Cybr-deficienti e wild type, sono stati caratterizzati a livello fenotipico e funzionale i linfociti presenti nei tumori, nei linfonodi drenanti e nelle milze al momento della massima crescita tumorale (giorni 11-15). Abbiamo riscontrato un ridotto numero di linfociti T CD4+ e CD8+ e di CTL antigene specifici nella popolazione infiltrante il tumore nei topi Cybr-deficienti. Tuttavia questa differenza si è ridotta alla fine del periodo analizzato.
Inoltre, un ritardo simile è stato riportato nello sviluppo dell’attività litica nei CTL provenienti da topi Cybr-KO rispetto a topi wild type. Al contrario, linfociti T memoria wild type e Cybr-KO non hanno mostrato nessuna differenza in termini di attività litica. Complessivamente, questi dati indicano che la deficienza di Cybr ha un significativo impatto nell’attivazione delle cellule T naive e nella loro espansione dopo il priming, ma non definiscono se questa proteina influenzi maggiormente la fase di priming e/o adesione cellulare o il trafficking e la migrazione delle cellule del sistema immunitario. Per chiarire questi aspetti, sono stati trasferiti linfociti T naive provenienti da topi Cybr-KO/GFP o B6/GFP in topi RAG2-/-γc-/- inoculati con il complesso retrovirale. Questi topi mancano di cellule T, B e NK e non regrediscono spontaneamente i tumori M-MSV indotti. Nonostante l’infusione di cellule T, i tumori hanno continuato a crescere, indicando che le cellule T naive non sono state in grado di montare una risposta immune pienamente efficace in questo modello, un aspetto probabilmente dovuto ad un reclutamento e priming sub ottimali nei linfonodi, che sono risultati ipoplastici. Al fine di rispondere a questi quesiti biologici, topi B6 nu/nu atimici ricostituiti con tessuto midollare depleto di linfociti T provenienti da topi wild type o Cybr-KO e successivamente infusi con linfociti T naive o memoria provenienti da topi Cybr-KO/GFP o B6/GFP, dovrebbero costituire un modello sperimentale ottimale per investigare il ruolo di Cybr sia nel comparto T che nel comparto APC.
Nell’insieme, i risultati ottenuti indicano che la deficienza di Cybr ha un significativo impatto nella risposta immune antigene-specifica, ma studi addizionali devono essere condotti al fine di definire con maggior precisione il ruolo di Cybr nella fase di priming e nel ritardo dello sviluppo dell’attività litica

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Rosato, Antonio
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 25 > Scuole 25 > ONCOLOGIA E ONCOLOGIA CHIRURGICA
Data di deposito della tesi:30 Gennaio 2013
Anno di Pubblicazione:30 Gennaio 2013
Parole chiave (italiano / inglese):CYBR / CYBR, biodistribuzione delle cellule T / T cell trafficking, adesione delle cellule T / T cell adhesion, linfociti T citotossici / cytotoxic T lymphocytes, oncogenesi virale / viral oncogenesis
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/06 Oncologia medica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Chirurgiche Oncologiche e Gastroenterologiche
Codice ID:5853
Depositato il:15 Ott 2013 10:00
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