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Calo', Stefano (2013) Identification and functional characterization of human cytomegalovirus
Surface exposed glycoproteins.
[Tesi di dottorato]

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3597Kb

Abstract (inglese)

The reverse vaccinology approach to the human cytomegalovirus (HCMV) genome, one of the
largest known mammalian viral genome with a coding potential of more than 166 proteins, led to
the identification of 94 potential membrane-associated or secreted proteins. Many of the selected
proteins have no assigned functions but share a high degree of conservation among different strains.
These designed ORFs have been synthesized as eukaryotic codon-optimized sequences in frame
with both hexa-histidine tail and c-myc tag coding elements. A more detailed analysis was
performed on a certain number of these tagged proteins in both epithelial and fibroblast human
derived cell lines, natural targets of HCMV. As starting point 12 hCMV proteins with antigenic
properties were chosen for further characterization in terms of structural and functional features.
This work was aimed to the identification and functional characterization of two new HCMV
surface exposed glycoproteins.
The study is divided in two parts: first the identification and characterization of ORFX*; second the
identification and characterization of a novel HCMV Fc binding protein. Regarding the first part,
we focused our attention on ORFX gene product, a putative ORF identified by in silico analysis.
Biochemical analysis on both ORFX viral protein product or transient expressed single gene
allowed us to conclude that ORFX is: a) heavily glycosylated protein; b) expressed as late product
during infection; c) present in the assembly complex, the cellular site of virus assembly; d) present
on the HCMV virion envelope and e) secreted in transient expression as by in silico prediction.
These observations led us to search for ORFX partners among other HCMV envelope exposed
glycoproteins. We found that gH was efficiently transported to plasma membrane only when coexpressed
with ORFX. Moreover, co-expression of gH (and gH/gL) with ORFX and coimmunoprecipitation
experiments, carried on both transfected and infected cells, showed that
ORFX is part of a gH-based complex. These results suggest that ORFX could function as both gH
“escort” protein but also be part of a cellular recognizing complex and invite to a deeper analysis of
both its functions and immunological properties.
Regarding the second part of the study, we were able to identify two novels Fc binding protein
coded by CMV: RL12 and RL13. The latter was also further characterized as recombinant protein
in terms of cellular localization, Fc binding site and IgG internalization ability.
*Names and protein sequences are, actually, under revision of NVD Intellectual property office

Abstract (italiano)

Riassunto
L’approccio di Reverse vaccinology applicato all’intero genoma del cytomegalovirus umano
(HCMV), uno dei genomi più estesi all’interno della famiglia degli herpesviruses umani, ha portato
all’identificazione di 94 ORF predette come codificanti per proteine di membrana o proteine
secrete. La gran parte delle ORF selezionate non ha alcuna funzione assegnata pur rimanendo
altamente conservata in tutti i ceppi conosciuti di HCMV. Tali ORF sono state inserite in vettori
d’espressione eucariotici aggiungendovi una porzione C-terminale codificante per i tags His e myc.
L’ analisi dettagliata riguardante le proprietà antigeniche dei prodotti proteici derivanti dalla
trasfezione in cellule epiteliali e fibroblasti umane dei plasmidi in questione ha prodotto la selezione
di 12 proteine virali.
Questo lavoro di tesi è stato incentrato sull’ identificazione e caratterizzazione funzionale di due
nuove glicoproteine presenti sulla membrana esterna di HCMV.
Lo studio è diviso in due parti: in prima analisi, l’identificazione e la caratterizzazione di ORFX*;
in seconda analisi l’identificazione e caratterizzazione di RL13 come Fc binding protein.
Riguardo la prima parte del lavoro, l’attenzione è stata focalizzata sul prodotto genico di ORFX
inzialmente identificata solo attraverso analisi in silico. Analisi biochimiche su ORFX prodotta in
infezione e talvolta in trasfezione di cellule umane hanno portato i seguenti risultati: 1) ORFX è una
proteina estesamente glicosilata 2) Vene prodotta nelle fasi tardive di espressione lungo il ciclo di
replicazione virale, 3) è presente nel sito di assemblaggio virale (Assembly complex) in cellule
infettate da HCMV, 3) è esposta sulla sua membrana esterna del virus,4) Viene secreta dalle cellule
che la esprimono in maniera transiente come da predizioni. Queste osservazioni ci hanno guidato
verso l’idea di cercare dei possibili partner proteici tra quelli conosciuti come presenti sull’envelope
esterno virale. A tal proposito abbiamo riscontrato che gH veniva trasportato nella membrana
plasmatica cellulare solo quando co-espressa con ORFX e viceversa. La Co-immunoprecipitazione
di ORFX e gH da lisati di cellule infettate e trasfettate con i singoli geni ha rivelato la diretta
interazione tra le due proteine identificando ORFX come parte di un complesso “gH based”. Questi
risultati delineano un ipotetica funzione di ORFX come proteina potenzialmente implicata nell’
“escort” di gH e talvolta parte di un complesso virale possibilmente riconosciuto dall’host.
Riguardo la seconda parte del lavoro di tesi, i risultati sono riguardanti l’identificazione due nuove
“Fc binding proteins” codificate da HCMV :RL 12 e RL13. Quest’ultima è stata sottoposta a
caratterizzazione biochimica nella sua forma ricombinante in termini di localizzazione
intracellulare, studio del sito di legame per le Fc e abilità della proteina a promuovere
l’internalizzazione cellulare delle IgG nel contesto dei meccanismi virali di immuno-evasione.
*Nomi e sequenze proteiche sono attualmente sotto la revisione dell’ufficio brevetti NVD

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Montecucco , Cesare
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 26 > Scuole 26 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > BIOLOGIA CELLULARE
Data di deposito della tesi:16 Gennaio 2014
Anno di Pubblicazione:16 Gennaio 2013
Parole chiave (italiano / inglese):HCMV
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:6259
Depositato il:03 Nov 2014 14:15
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