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Manno, Nicola (2013) Binomio Chitina-Chitinasi in popolazioni indigene andino-amazzoniche del PerĂš. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

Chitin is the second most abundant structural biopolymer, present in human
pathogens and in human foods, such as arthropods and fungi (Muzzarelli et al., 2012).
Humans have two enzymatically active Chitinases, coded by 2 paralogous genes:
Chitotriosidase (CHIT, gene CHIT1) and Acidic Mammalian Chitinase (AMCase, gene
CHIA). CHIT has an optimum pH of 6 and is expressed in macrophages and found
prestored in neutrophil granules, and over-expressed during malaria infection, so
takes part to innate immunity (Musumeci & Paoletti, 2009). Interestingly, the
enzymatic deficiency of CHIT (due to a 24-bp duplication on CHIT1 exon 10, named
Allele H) is frequent in many human populations (Gianfrancesco & Musumeci, 2004),
suggesting that chitinolytic function could be redundant for this Chitinase (Piras et al.,
2007).
AMCase is expressed mainly in epithelial cells, and over-expressed in
alternatively activated macrophages, during Th2 (T-helper type 2) humoral responses
to helminth parasites and during asthmatic responses to chitin particles, suggesting
that AMCase maintains the immunologic function and take part to immune disorders
(Reese et al., 2007). AMCase is also expressed in stomach, but not in duodenum and
gut (Boot et al., 2005), and showed chitinolytic activity in human gastric secretions
(Paoletti et al., 2007). Indeed, this enzyme exerts enzymatic activity at different pH
levels: pH 2, 4.6 and 7, characteristic of stomach, lysosomes and lung respectively
(Seibold et al., 2009). Three non-synonymous SNPs on CHIA exon 4 are known to
cause three amino-acidic changes in proximity of the catalytic-domain, so to directly
influence the pH specificity of the isoforms (Olland et al., 2009).
This PhD study investigates Chitinase functional variants in 5 Amerindian
populations of Peruvian Amazon and Andes, respect to the main environmental
factors of chitin exposure: the indigenous diet, specifically the consumption of
arthropods, and intestinal parasites.
Methods
Ethnobiological descriptive study of the traditional diet, especially insects and
crustaceans. Copro-parasitological analysis, for eggs/oocysts/larvas detection and
determination, of 76 Amerindians from 3 communities of AwajĂşn, Ashaninka and
Shipibo peoples. Difference-similarity statistical analysis between Peruvian
Amerindians and world-wide human populations, based on the distribution of chitincontaining
parasites (GIDEON database).
Genotyping of CHIT1 duplication by sequencing and electrophoresis, from 85
Amerindians and 50 urbanized controls, see Piras (2007). To sequence CHIA gene in 9
Amerindians, and promoter region and exon 4 in a sample of 75 Amerindians and 29-
39 controls, respectively. Enzymatic restriction for the detection of the known variant
on exon 12. Analysis of human diversity of CHIA gene based on 14 populations
(ENSEMBL database).
Results
Chitin exposure was assessed in relation to the main environmental factors:
arthropods-based diet (species) and high enteroparasites’ prevalence. Ethnobiological
data confirmed traditional dietary habits: in AwajĂşn, Ashaninka, Quechua-Lamas was
observed an alimentation based on wild biodiversity, including daily consumption of
insects, crustaceans and fungi. Also Shipibo people confirmed inset consumption and
other traditional dietary habits before migrating to Lima. In the three populations
interested by parasitological analysis was assessed a high prevalence of
enteroparasites: 35-43% for nematodes, 35-61% for protozoans and 3-29% for
Hymenolepis nana. The main chitin-containing parasites found in this sample
population were the protozoan Giardia lamblia, Entamoeba histolitica; and the macroparasites
Ancylostoma/Necator, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichiuris
trichura and Hymenolepis nana. Differently, westernized food habits and lower parasite
prevalence (2-12%) characterize the control population of urbanized Peruvians.
The comparative analysis of enteroparasites’ distribution in human
populations showed that Amerindians are exposed to a reduced pattern of chitin
containing macro-parasites, and the most severe ones (trematodes and filarial
nematodes) are absent in rural andean-amazonic Peru, as confirmed in other studies
conducted in Peruvian Amazon (Ibanez et al., 2004; GIDEON database).
The 24-bp duplication causing catalytic deficiency resulted highly conserved,
with a frequency of 47.06% in the whole Amerindian sample, and 27.55% in Peruvian
controls. This frequency rate is the second highest worldwide, after Chinese Han
population (Choi et al., 2001; Piras et al., 2007). Genotypic frequencies were consistent
with the Hardy Weinberg Equilibrium, within each indigenous population and in
total Amerindians (X²= 0.006; p = 0.939), excluding the presence of selective pressure
on this allele. Peruvian control population has the highest, even not significant,
deviation from expected values (p = 0.091).
CHIA exon 4 encodes for the catalytic domain of Acidic Mammalian
Chitinase, and 3 SNPs (A290G, G296A, G339T) are known to determine pH optimum
of enzymatic activity. The “AGG” haplotype, wild-type in Humans, is conserved in
Peruvian Amerindians, with a frequency of 96% and a high degree of homology and
homozygosis within and among the five populations. Is known that this isoform
maintains the enzymatic activity at lysosomes’ pH of 4.6, but at stomach pH (2), and
lung pH (7), it is respectively reduced and ablated (Seibold et al., 2009).
From the analysis of the entire gene sequence, by considering the allelic
frequency distribution and Fst between pairs of populations, emerged several relevant
polymorphisms, rare in humans and fixed in Amerindians. Variants rs12023321,
rs35042265, rs4554721, rs4442363, rs11102235, rs34698010, rs12026825, rs2275253 (exon
10), rs2256721 (exon 12), presenting high frequencies of the derived allele (93-95%),
and rs12033184, rs4546919, re2275254 (exon 11), presenting the ancestral allele.
Discussion
Both ethnobiological and parasitological studies gave evidences of a
conserved traditional lifestyle, strongly influenced by environmental factors and,
specifically, by high exposure to chitin-containing parasites (especially helminths) and
unconventional foods, including chitinous invertebrates. However parasite diversity
showed that Amerindians do not suffer parasitoses from histozoic species like
trematods (Schistosoma and Fasciola), Taenia sp., and filarial nematodes, that have
complex lifecycles inducing granulomas and fibrosis in different human organs (liver,
brain, lymphatic system etc.) (Jackson et al., 2009; Anthony et al., 2007).
Even if no correlation analysis between Chitinases’ genotype and parasite
infection is possible with present data, Chitotriosidase inactive variant is absolutely
high and higher respect to controls, thus we can deduce that the reduced pattern of
chitin-containing enteroparasites isn’t acting any selective pressure for the functional
Chitotriosidase, in our sample. We can also exclude that the functional variant is
conserved in control population (WT freq: 73%) because of enteroparasites’ pressure,
which are scarce in urban areas. Rather, mixing with Europeans and Africans during
last centuries may have determined high WT frequencies in non-ethnic Peruvians. The
inactive variant is absent in non-human primates, and in most African populations,
and Asiatic populations - Chinese Han (58%) (Chien et al., 2005) y India (40%) (Choi et
al., 2001) – have the highest frequencies, suggesting that this “mutation” occurred
after human migration out of Africa (Piras et al., 2007). Considering that first
inhabitants of New World descend from eastern-Asia populations, is it plausible that
the duplication is highly conserved for a founder effect in all South American
Amerindians.
The CHIA coding sequence and promoter present a specific haplotype, with
many loci with high frequency of the derived allele (93-96%), most rare in Africans
and Europeans (<30%), so candidates for positive selection. Such variants are localized
in promoter region and in the last three exons (10, 11 and 12), coding for the chitinbinding
domain, therefore a functional reorganization involving gene expression and
chitin-binding site is probable in South Amerindians. Intriguingly, these three nonsynonymous
variants are associated with Th2 asthmatic phenotypes in Central
Americans and Europeans, suggesting further links between man-helminths coevolution,
AMCase functionality and immunologic disorders (Anthony et al., 2007).
Only the polymorphism re2275254 (T1218C, Phe354Ser), on exon 11, presented high
frequencies of the ancestral allele in tropical Africa and South America, and lower
frequencies in temperate regions of Asia and Europe. This is a relevant feature of
geographic distribution for functional alleles (Coop et al., 2009), evidently associated
to the latitudinal variation of parasites’ distribution.

Abstract (italian)

La chitina è un polisaccaride-azotato insolubile presente in strutture di
patogeni dell’Uomo e in alimenti come artropodi e funghi (Muzzarelli et al., 2011). Gli
esseri umani hanno due chitinasi enzimaticamente attive, codificate da due geni
paraloghi: Chitotriosidasi (CHIT, gene CHIT1) e Acidic Mammalian Chitinase (AMCase,
gene CHIA). CHIT ha massima attivitĂ  enzimatica a pH 6, si esprime nei macrofagi,
ed è sovra-espressa durante infezione malarica, pertanto prende parte alla risposta
immunitaria innata (Musumeci et al., 2005). È interessante notare che la deficienza
enzimatica di CHIT1 (dovuta ad una duplicazione di 24 bp sull’esone 10 di CHIT1) è
frequente in molte popolazioni umane, e assente negli altri primati (Gianfrancesco &
Musumeci, 2004), suggerendo che la funzione chitinolitica, per questa chitinasi,
potrebbe essere ridondante nell’uomo (Piras et al., 2007). AMCase è espressa
prevalentemente in cellule epiteliali, e sovra-espressa in macrofagi specializzati
attivati durante risposte immunitarie umorali Th2 (T-helper di tipo 2) a infezioni da
elminti parassiti e durante risposte asmatiche a particelle di chitina, suggerendo che
AMCase mantiene la funzione immunologica e prende parte a disturbi del sistema
immunitario come atopie ed asma (Reese et al., 2007). AMCase si esprime anche nello
stomaco, ma non nel duodeno e nell'intestino (Boot et al, 2005). Infine, esercita attivitĂ 
enzimatica a pH 2 , 4.6 e 7, caratteristici di stomaco, lisosomi e polmoni,
rispettivamente (Seibold et al, 2009), difatti le secrezioni gastriche umane esercitano
attivitĂ  chitinolitica dovuta a AMCase (Paoletti et al, 2007; Cozzarini et al, 2009).
Obbiettivi
Studiare il binomio chitina-chitinasi in comunità native dell’Amazonia e
Ande del PerĂş, che vivono in condizioni di elevata esposizione a chitina ambientale,
rispetto a un gruppo controllo di popolazione urbanizzata. Descrivere due dei
principali fattori di esposizione alla chitina: la dieta e gli elminti. Con un approccio
evoluzionistico e il supporto di differenti strumenti bioinformatici, verranno discusse
le possibili correlazioni tra la variabilitĂ  genetica delle chitinasi e la diffusione di
parassiti intestinali e distubi associati alle chitinasi, nelle popolazioni mondiali.
Metodi
Studio etnobiologico descrittivo della dieta tradizionale, soprattutto di insetti
e crostacei. Analisi copro-parassitologica per individuazione e determinazione di
uova/oocisti/larve in 76 amerindi di origine Awajun, Ashaninka e Shipibo. Analisi
statistica di similarità–distanza tra gli Amerindi e casi studio in diverse popolazioni
mondiali, in base alla prevalenza di parassiti contenenti chitina (database GIDEON).
Genotipizzazione della duplicazione CHIT1 mediante sequenziamento e
elettroforesi, in 85 Amerindi e 50 controlli urbanizzati. Sequenziamento del
promotore e esone 4 di CHIA (75 Amerindi, e 39 controlli, rispettivemente).
Restrizione enzimatica per genetipizzare la variante nota sull’esone 12, in parte del
campione. Studio della variabilitĂĄ del gene CHIA in 14 popolazioni (database
ENSEMBL).
Risultati
I dati etnobiologici hanno confermato, in AwajĂşn, Ashaninka, Quechua-Lamas,
una alimentazione basata sulla biodiversitĂ  selvatica, tra cui il consumo giornaliero di
insetti, crostacei e funghi; gli Shipibo che vivono a Lima hanno confermato abitudini
alimentari tradizionali e consumo di artropodi prima di migrare; i Quechua del Cusco
(3000-4000 mslm), consumano saltuariamente larve di coleottero e bruchi. Nelle tre
popolazioni interessate dalle analisi parassitologiche (Awajun, Ashaninka e Shipibo), è
stata accertata un’elevata prevalenza di enteroparassiti: 35-43% per i nematodi, 35-
61% per i protozoi e 3-29% per Hymenolepis nana (l'unico platyhelminto riscontraro). I
parassiti contenenti chitina piĂš frequenti nella popolazione campione erano i protozoi
Giardia lamblia, Entamoeba histolitica, e i macro-parassiti Ancylostoma/Necator, Ascaris
lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichiuris trichura e Hymenolepis nana.
Diversamente, la popolazione di controllo di peruviani urbanizzati presenta abitudini
alimentari occidentalizzate e una bassa prevalenza di elminti intestinali (2-12%).
L'analisi comparativa della distribuzione di enteroparassiti in popolazioni
umane ha dimostrato che gli Amerindi sono esposti a una gamma ridotta di elminti
contenenti chitina, e che le specie istozoiche piĂš severe (trematodi, Taenia e filarie)
sono assenti in popolazioni dell’Amazzonia peruviana (Ibanez et al., 2004), e nalla
banca dati on-line GIDEON.
La duplicazione 24 bp che causa la deficienza enzimatica in Chitotriosidasi
risultata altamente conservata, con una frequenza di 47.06% negli Amerindi, e 27,55%
nei peruviani. Questa frequenza è la seconda piÚ alta al mondo, dopo la popolazione
cinese Han (Choi et al., 2001). Le frequenze genotipiche rispettano l’Equilibrio di
Hardy Weinberg nelle singole popolazioni, nella popolazione totale (X ² = 0.006, p =
0,939), escludendo la presenza di pressione selettiva per questo allele. Nel gruppo di
controllo è stato riscontrato il maggior discostamento dai valori attesi (p = 0,091;
significativo con p < 0,05).
L’esone 4 di CHIA codifica il dominio catalitico: 3 SNP (A290G, G296A,
G339T) sono noti per ridurre l’attività enzimatica a differenti pH. L' aplotipo "AGG",
wild-type (WT) negli umani, è conservato anche negli Amerindiani peruviani con una
frequenza del 96 % e un alto grado di omologia e omozigosi. Dalla sequenza WT negli
Amerindi, sono emerse numerose sostituzioni in loci molto variabili nelle popolazioni
umane. In base al confronto con l’allele ancestrale, alla distribuzione delle frequenze
alleliche e l’Fst per coppie di polazioni, numerosi polimorfismi a livello del promotore
e 5’UTR, e tre varianti non-sinonime (rs2275253, esone 10; re2275254, esone 11;
rs2256721, esone 12), risultano fissate nelle popolazioni amerindiane.
Discussione
Gli studi etnobiologico e parassitologico hanno accertato uno stile di vita
tradizionale, fortemente influenzato da fattori ambientali e, in particolare, da
un’elevata prevalenza di macroparassiti contenenti chitina e da un intenso consumo
di invertebrati selvatici. Tuttavia gli amerindi non conoscono numerose specie di
parassiti istozoici: trematodi (Schistosoma e Fasciola), Taenia, e delle filarie, che non
sono enteroparassiti, hanno cicli biologici complessi e possono produrre granulomi e
fibrosi in diversi organi (fegato, cervello, sistema linfatico, muscoli) (Jackson et al.,
2009; Anthony et al, 2007).
Anche se i dati raccolti non permettono di realizzare analisi di correlazione
tra genotipi e infezioni parassitarie, la deficienza enzimatica di Chitotriosidasi è
assolutamente elevata e maggiore rispetto alla popolazione peruviana. Possiamo
quindi dedurre che gli enteroparassiti riscontrati non esercitino pressione selettiva in
favore di una Chitotriosidasi funzionale, nel nostro campione. Possiamo anche
escludere che la Chitotriosidasi funzionale (WT freq.: 72,45%) siĂ  piĂš frequente nella
popolazione di controllo in risposta agli enteroparassiti, che sono meno frequenti in
aree urbane. PiĂš probabilmente, la migrazione di Europei e Africani dopo la
conquista può aver determinato alte frequenze del allele WT nei peruviani non-etnici
e in altri paesi centro e sud americani come Messico (76%)(JuĂĄrez-RendĂłn et al., 2012) e
Brasile (74%)(Adelino et al., 2010). Questa "mutazione" è assente nei primati e in molte
popolazioni africane (Benin: 0%; Burkina Faso: 0,2%) (Piras et al., 2007), mentre
mostra le frequenze piĂš alte nelle popolazioni asiatiche: Cinese Han (58%) (Chien et
al, 2005); India 40% (Choi et al., 2001), suggerendo che questa variante sia emersa
dopo la migrazione dell’uomo dal continente africano (Piras et al., 2007).
Consideranto che i primi abitanti del Nuovo Mondo provennero da popolazioni
dell'estremo est-asiatico tra 6 e 30 anni fa, è plausibile che le alte frequenze della
mutazione (>40%) siano dovute all’effetto del fondatore, e potrebbero dunque essere
conservate in tutte le popolazioni indigene del Sud America.
Il gene CHIA (esoni e promotore 1000 bp dal 5’UTR) presentano un aplotipo
specifico, con molti loci che presentano alta frequenza dell'allele derivato (95%), raro
negli Africani e negli Europei (<30%), quindi candidati come loci interessati da
pressione selettiva. Tali varianti sono localizzate nella regione del promotore e negli
ultimi tre esoni (10, 11 e 12), influenzando la funzionalità del sito de legame. E’
rilevante notare che le tre varianti non-sinonime sono associate a fenotipi asmatici
Th2 in Centroamericani ed Europei, suggerendo ulteriori legami tra la co-evoluzione
uomo-elminti, la funzionalità di AMCase e disordini immunologici. Si può pertanto
ipotizzare che negli Amerindiani sia avvenuta una riqualificazione funzionale che
coinvolge l'espressione genica e il sito di legame. Solo il polimorfismo re2275254
(T1218C, Phe354Ser), esone 11, ha alte frequenze dell'allele ancestrale sia in Africa
tropicale che in Sud America, e frequenze piĂš basse nelle regioni temperate di Asia ed
Europa, che è un cline rilevante di distribuzione geografica per un allele funzionale
(Coop et al., 2009), associato alla variazione latitudinale dei principali fattori
ambientali, che influenzano la distribuzione dei parassiti.

Statistiche Download
EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Mostacero Leon, JosĂŠ and Mostacciuolo, Maria Luisa
Supervisor:Paoletti, Maurizio Guido
Ph.D. course:Ciclo 26 > Scuole 26 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > GENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE DELLO SVILUPPO
Data di deposito della tesi:21 January 2014
Anno di Pubblicazione:02 December 2013
Key Words:chitina, chitinasi umane, PerĂš, Awajun, Ashaninka, Shipibo, Quechua, Lamas, insetti commestibili, macroparassiti intestinali, genotipo, varianti funzionali, ipotesi dell'igiene
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/07 Ecologia
Area 05 - Scienze biologiche > BIO/18 Genetica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:6281
Depositato il:25 Oct 2018 17:58
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