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Boscutti, Giulia (2014) Gold-based anticancer derivatives of oligopeptides: synthesis, characterization, delivery strategies and biological activity. [Tesi di dottorato]

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Tesi non accessible fino a 31 Dicembre 2017 per motivi correlati alla proprietà intellettuale.
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Abstract (inglese)

At present, cisplatin (cis-diamminodichloroplatinum(II)) is one of the most largely employed anticancer drugs, used especially for the treatment of testicular cancer and, in combination with other drugs, of ovarian, small cell lung, bladder, brain, and breast tumors. Anyway, despite its high effectiveness, it exhibits severe drawbacks, as normal tissue toxicity (in particular, nephrotoxicity) and intrinsic or acquired resistance to the treatment. To overcome these problems, new Pt- and other metal-based complexes were designed and tested as anticancer drugs. In particular, since gold-based complexes were linked for centuries to the treatment of rheumatoid arthritis (due to their antiinflammatory and immunosuppressive properties), they were also tested for their antiproliferative properties..
In the last decade in our research group, some Au(III)-dithiocarbamato derivatives were synthesized, characterized and tested, showing outstanding antiproliferative activity on human cancer cells.
Starting from the promising results obtained both in vitro and in vivo for the “first generation" compounds of formula [AuIIIX2(dtc-L)] (X= Cl, Br; dtc=dithiocarbamato; L= dimethylamine, pyrrolidine, N-methyl glycine (Sar) esters), a "second generation" of complexes was designed to improve bioavailability, selectivity and cellular uptake. In particular, the dithiocarbamato moiety was functionalized with different oligopeptides of general formula [AuIIIX2(dtc-Sar/Aib-(AA)n)] (AA= different aminoacids), to be recognized and uptaken by specific peptide transporters called PEPTs (PEPT1 and PEPT2), predominantly present in epithelial cells of small intestine, mammary glands, lung, choroid plexus and kidney, and overexpressed in some tumor types. A unique feature of these transporters is their capability for sequence-independent transport of most possible di- and tripeptides, thus representing excellent targets for the delivery of pharmacologically-active peptidomimetics such as ß-lactam antibiotics and some angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors. Interestingly, these complexes demonstrate high capability to strongly inhibit tumor cells growth by exploiting a mechanism of action different from the clinically-established platinum drugs, overcoming drawbacks without any observed cross-resistance.
In this PhD thesis work, new Au(III)-peptidodithiocarbamato complexes were synthesized and fully characterized, mainly by means of elemental and X-ray analysis, mono- and bidimensional NMR, FT-IR and UV-Vis spectroscopy.
The water-insoluble compounds, previously dissolved in DMSO, showed high reactivity in aqueous conditions, generally undergoing hydrolysis of the bromido ligands which leads to the formation of the water insoluble dihydroxo derivative. Nevertheless, when analyzing more complex environments, as cell culture medium, a stabilizing effect seemed to be exerted by the components of the medium itself (e.g., proteins, organic molecules), as confirmed by interaction studies with the serum carrier protein BSA (Bovine Serum Albumin).
The antiproliferative activity of the complexes was tested on different human cancer cell lines, representative of different cancer types (e.g. lung, ovary, breast), showing promising cytotoxicproperties. Furthermore, their antitumor activity was confirmed in vivo on breast MDA-MB-231 human xenografts, while their toxicological profile, preliminary evaluated ex vivo, was similar to the "first generation" compounds.
To overcome the solubility problem in aqueous conditions and to avoid the intrinsic toxicity of DMSO (normally used as primary solvent), new solubilizing methods were explored. In particular, micelles based on Pluronic F127 and liposomes based on DPPC phospholipids were prepared, characterized and tested in vitro. These systems were proved to stabilize the compounds in physiological conditions, without affecting their antiproliferative activities. Moreover, micelles functionalized with CCK8 octapeptide were tested as targeting moieties to be selectively delivered to cancerous cells overexpressing the CCK-receptors. In this case, the GI50 values of the encapsulated compounds were improved of one order of magnitude.
To achieve more information about their mechanism of action, the interaction in vitro with some purified enzymes was performed, confirming that the complexes inhibit all the three enzymatic functions of the proteasome, together with the activity of PARP-1 enzyme.
More detailed studies, taking into account the kinetics of gold uptake by cells and the real-time inhibition of cell growth and adhesion, suggested that the complexes probably exert their cytotoxic effect on cells in the 4-5 h after administration, acting probably at the membrane level.
All together these results highlight the promising properties of the complexes as anticancer agents, and put the basis for the pursuance of the preclinical characterization, including deeper studies of their pharmacological properties and biological activity.


I wish to aknowledge my supervisor Prof. Dolores Fregona and all her Research Group.
A particular thanks goes to Prof. Dalla Via, Prof. Formaggio, Prof. Di Noto.
I want also to acknowledge Prof. Angela Casini for the ospitality in her Research Group at the Research Institute of Pharmacy of the University of Groningen (The Netherlands).
A special thank goes to Fondazione CARIPARO, for funding this PhD project.
Finally, I want to thank the Doctoral School of Molecular Sciences, its Coordinator Prof. Antonino Polimeno and the members of my three-year committee Prof. Formaggio, Prof. Badocco and Prof. Zagotto.

Abstract (italiano)

Il cisplatino (cis-diamminodicloroplatino(II)) è tuttora uno dei farmaci antitumorali più utilizzati, impiegato in particolare per il trattamento del tumore al testicolo e, in combinazione con altri chemoterapici, per la cura del cancro all'ovaio, al polmone a cellule piccole, alla vescica, al cervello e alla mammella. Nonstante la sua efficacia, il suo utilizzo viene fortemente limitato dall'insorgenza nei pazienti di effetti collaterali molto gravi, come l'elevata tossicità verso i tessuti sani (in particulare nefrotossicità) oltre che da meccanismi di resistenza al trattamento o acquisiti dopo alcuni cicli di terapia.
Per superare questi inconvenienti, sono stati sintetizzzati e testati come potenziali farmaci antitumorali nuovi complessi sia a base di platino che di altri metalli di transizione.
In particolare, alcuni composti di oro, già utilizzati da molti anni per la cura dell'artrite reumatoide (grazie alle loro proprietà anti-infiammatorie e immunosuppressive) sono stati testati per le loro proprietà antiproliferative, aprendo la strada a una nuova classe di potenziali composti antitumorali.
Da circa un decennio nel nostro gruppo di ricerca sono stati sintetizzati, caratterizzati e testati nuovi complessi ditiocarbammici di oro(III), che hanno dimostrato promettenti proprietà antiproliferative su diverse linee cellulari tumorali umane. I promettenti risultati ottenuti sia in vitro che in vivo per alcuni composti di “prima generazione” del tipo [AuIIIX2(dtc-L)] (X= Cl, Br; dtc=ditiocarbammato; L= dimetilammina, pirrolidina, esteri della N-metilglicina (Sar)), hanno portato al design di una nuova serie di complessi di "seconda generazione", al fine di aumentarne la biodisponibilità, la selettività e l'uptake cellulare.
A questo scopo, sono stati preparati complessi ditiocarbammici funzionalizzati con diversi oligopeptidi, aventi formula generale [AuIIIX2(dtc-Sar/Aib-(AA)n)] (AA = diversi amminoacidi), affinchè potessero essere riconosciuti e trasportati da specifici trasportatori di membrana denominati PEPT (PEPT1 and PEPT2). Queste proteine risultano prevalentemente espresse nelle cellule epiteliali dell'intestino tenue, nella mammella, nel polmone, nel plesso coroideo e nei reni, e vengono in particolare sovraespresse in alcuni tipi di cellule tumorali. La principale caratteristica di queste biomolecole è la loro capacità di trasportare la maggior parte dei di- e tri-peptidi naturali, indipendentemente dalla loro sequenza, dimostrandosi quindi degli eccellenti target per il riconoscimento ed il trasporto selettivo di composti peptido-mimetici farmacologicamente attivi, quali ad esempio antibiotici ß-lattamici ed alcuni inibitori di enzimi convertitori dell'angiotensina (ACE).
I complessi sintetizzati hanno mostrato ottime proprietà antiproliferative, esercitando un meccanismo d'inibizione della crescita tumorale diverso da quello normalmente descritto per i farmaci a base di platino comunemente utilizzati in chemoterapia clinica, superandone anche i tipici effetti collaterali e i problemi di resistenza crociata al trattamento.
In questo lavoro di tesi sono stati sintetizzati nuovi complessi di Au(III) con leganti peptidoditiocarbammici, i quali sono stati ampiamente caratterizzati attraverso analisi elementare e di diffrazione a raggi-X su monocristallo, NMR mono- e bidimensionale, FT-IR e spettroscopia Uv-Vis.
I complessi non-idrosolubili (previa dissoluzione nella minima quantità di DMSO) si sono dimostrati molto reattivi in soluzioni acquose caratterizzate da diverse condizioni di pH o di composizione salina. Generalmente essi tendono ad idrolizzare, scambiando con l'acqua un legante bromuro e portando alla formazione del di-idrosso derivato, insolubile in acqua. Andando però ad analizzare ambienti più complessi, come ad esempio il mezzo di coltura cellulare, è stato notato un effetto stabilizzante derivante probabilmente dalla presenza di particolari componenti del mezzo stesso (e.g. proteine, molecole organiche), come confermato anche da studi di interazione con la proteina del siero BSA (Bovine Serum Albumin).
L'attività antiproliferativa dei complessi è stata testata su diverse linee cellulari di tumori umani, rappresentative di diversi tipi tumorali (e.g. polmone, ovaio, mammella), mostrando promettenti attività citotossiche. La loro attività antitumorale è stata ulteriormente confermata in vivo sul tumore xenografico umano alla mammella MDA-MB-231, mentre una valutazione preliminare del profilo tossicologico effettuata ex vivo ha messo in luce un'analogia con i risultati ottenuti per uno degli analoghi composti di "prima generazione".
Per superare il problema della scarsa solubilità in soluzioni acquose, oltre che per evitare la tossicità intrinseca del DMSO (normalmente utilizzato per sciogliere i complessi), sono stati valutati nuovi metodi di dispersione. In particolare, sono state preparate, caratterizzate e testate in vitro sia micelle a base di Pluronico F127 che liposomi costituiti da fosfolipidi DPPC. Questi sistemi si sono dimostrati in grado di solubilizzare e stabilizzare i complesi in condizioni fisiologiche, senza tuttavia alterarne le proprietà antiproliferative. Inoltre, micelle funzionalizzate con l'octapeptide CCK8 sono state testate come nanosistemi per il trasporto selettivo verso le cellule tumorali che sovraesprimono il recettore specifico CCK-R. In questo caso i valori di GI50 registrati sono risultati di un ordine di grandezza inferiori rispetto allo stesso sistema non funzionalizzato.
Per ottenere maggiori informazioni sul meccanismo d'azione dei complessi, ne è stata in seguito valuatata la capacità di inibire in vitro alcuni enzimi selezionati per la loro rilevanza nell'attivazione della risposta apoptotica nelle cellule tumorali. I composti si sono dimostrati in grado di inbire tutte e tre le funzioni del proteasoma, inibiendo contemporaneamente anche l'attività dell'enzima PARP-1.
Studi più dettagliati hanno in seguito riguardato la cinetica di uptake dei complessi di oro da parte delle cellule tumorali, e la valutazione in tempo reale del profilo dell'inibizione della crescita cellulare. I risultati ottenuti hanno suggerito che i complessi esplicano la loro attività citotossica nelle prime 4-5 h dalla somministrazione, agendo probabilmente a livello della membrana cellulare.
Questi risultati sottolineano le promettenti proprietà dei composti come potenziali agenti antitumorali, e gettano le basi per il proseguimento della loro caratterizzazione preclinica, la quale prevede una più approfondita valutazione delle loro proprietà farmacologiche e della loro attività biologica.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Fregona, Dolores
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 26 > Scuole 26 > SCIENZE MOLECOLARI > SCIENZE CHIMICHE
Data di deposito della tesi:27 Gennaio 2014
Anno di Pubblicazione:Gennaio 2014
Parole chiave (italiano / inglese):gold, dithiocabamates, cancer, drug design
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 03 - Scienze chimiche > CHIM/03 Chimica generale e inorganica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Chimiche
Codice ID:6288
Depositato il:31 Ott 2014 14:26
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