Vai ai contenuti. | Spostati sulla navigazione | Spostati sulla ricerca | Vai al menu | Contatti | Accessibilità

| Crea un account

Barbon, Giovanni (2014) Forme congenite di malattia di von Willebrand senza mutazioni nel gene del fattore von Willebrand: alla ricerca di un nuovo gene e di nuovi meccanismi patogenetici. [Tesi di dottorato]

Full text disponibile come:

[img]
Anteprima
Documento PDF (Barbon Giovanni Tesi Dottorato) - Altro
1069Kb

Abstract (inglese)

The von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein that plays a key role in the early stages of hemostasis. Quantitative or functional defects of the molecule cause von Willebrand disease (VWD), the most common inherited bleeding disorder. Currently, VWF is the only gene involved in the VWD onset. However, VWF mutations are not identified in a substantial proportion of VWD cases (25-30%) by using the standard sequencing techniques. In this PhD work we elaborated a diagnostic flow-chart for the systematic study of families with no identified VWF gene mutations. The flow-chart core is the accomplishment of a linkage analysis with VNTR (variable number tandem repeat) markers within the VWF gene to assess the involvement of the gene itself: if the VNTR haplotype and the disease co-segregate, the investigation of VWF gene must be carried out with the analysis of mRNA or Real-Time PCR; otherwise, the VWF gene involvement is excluded and a whole-genome investigation will be performed to discover a new causative gene. In A Family, VNTR markers co-segregated with the disease and VWF mRNA analysis highlighted an aberrant splicing caused by a synonymous substitution (c.7056C>T). This substitution, which has been described previously, was incorrectly classified as a polymorphism. On the basis of expression experiments performed in BHK cell line, it was also possible to point out the typical loss-of-function mechanism of the mutation. The mRNA analysis allowed to identify the mutation responsible for VWD in B Family: a genomic deletion of 3411 base pairs involving three exons of the VWF gene (c.5456_5842del). In this case, the transient expression in HEK293T cell line showed the mutation has a dominant-negative effect. Furthermore, recombinant fragments of VWF comprising A2-B3 domains were synthesized in E.coli to better characterize the effect of the deletion. These fragments were subjected to in vitro proteolysis with recombinant ADAMTS13, in order to verify the susceptibility of mutated VWF to the metalloprotease. These experiments showed that the mutation identified makes VWF resistant to the proteolytic action of ADAMTS13, thus explaining the presence of abnormally large multimers observed in the patient’s plasma. In the C Family, linkage analysis excluded the involvement of VWF gene in the VWD onset. Then, the FVIII gene was also ruled out by direct sequencing, so the search for a new causative gene was carried out. We used two different strategies simultaneously: the whole-genome sequencing and the genome-wide linkage analysis. Data derived from the two strategies were integrated and the results allowed us to identify ~900 variations in 396 genes that were spread across 4 different linkage regions (chromosome 5, 7, 15, X). The involvement of the "candidate" genes in the linkage regions was assessed in detail, but it has not been possible to identify the one responsible for the disease so far. To complete the analysis of this Family C a new sequencing step is required. The D Family, whose small size made impossible to perform the linkage analysis, is characterized by a reduction of circulating VWF survival. The evidence that the exogenous hemoderivative VWF had the same behavior ruled out the involvement of the VWF gene. The intervention of the metalloprotease ADAMTS13 was excluded by direct sequencing, while the search for anti-VWF antibody, in a context of autoimmune disease, was negative. In conclusion, the use of the proposed flow-chart allowed the characterization of two new mutations in the VWF gene, responsible for VWD in Families A and B. It should be emphasized that both mutations described can’t be detected with standard sequencing techniques, due to inherent limitations, while the mRNA sequencing suggested in the flow-chart allowed the characterization of two unresolved cases of VWD. In families C and D, the study has definitively excluded the involvement of the VWF gene, confirming the existence of other factors/genes that may cause the VWD .

Abstract (italiano)

Il fattore von Willebrand (VWF) è una glicoproteina multimerica che svolge una funzione fondamentale nelle prime fasi dell’emostasi. Alterazioni quantitative o funzionali della molecola causano la malattia di von Willebrand (VWD), la più frequente malattia emorragica ereditaria. L’unico gene a tutt’oggi riconosciuto come responsabile della VWD è il gene del VWF. Tuttavia in una percentuale rilevante di casi di VWD (25-30%) non sono identificate mutazioni a carico del gene VWF. In questo lavoro di Dottorato è stata elaborata una flow-chart diagnostica per lo studio sistematico di famiglie con VWD che non presentano mutazioni nel gene VWF. Il punto focale della flow-chart è l’utilizzo dell’analisi di linkage con marcatori VNTR (variable number tandem repeat) interni al gene del VWF, per valutare il coinvolgimento del gene stesso: se aplotipo di VNTR e malattia co-segregano l’indagine del gene VWF deve essere approfondita con l’analisi del mRNA o con la Real-Time PCR, in caso contrario viene proposta un’indagine estesa a tutto il genoma per la ricerca di un nuovo gene causativo. Nella prima famiglia studiata (Famiglia A), i marker VNTR segregavano con la malattia e l’analisi del mRNA del VWF ha permesso di evidenziare uno splicing aberrante causato da una sostituzione sinonimo (c.7056C>T), già erroneamente classificata come polimorfismo. L’espressione in vitro del VWF mutato, condotta in linea cellulare BHK, ha permesso di dimostrare che la mutazione agisce con un tipico meccanismo di loss-of-function. L’analisi del mRNA si è rivelata utile anche per identificare la mutazione responsabile della VWD nella seconda famiglia (Famiglia B): una delezione genomica di 3411 paia di basi che coinvolge tre esoni del gene VWF (c.5456_5842del). In questo caso, l’espressione transiente in sistema cellulare HEK293T ha evidenziato un effetto dominante-negativo della mutazione nel rilascio del VWF. Lo studio funzionale è stato invece condotto attraverso l’espressione, in batteri E.coli, di frammenti ricombinanti di VWF mutato e normale (A2-B3). Questi frammenti sono stati sottoposti in vitro all’azione di ADAMTS13, una metalloproteasi che ha come unico substrato il VWF di cui regola la struttura multimerica. Questi esperimenti hanno dimostrato che la mutazione c.5456_5842del rende il VWF resistente all’azione proteolitica di ADAMTS13, offrendo così una spiegazione alla presenza di multimeri a peso molecolare abnormemente elevato in pazienti portatori di questa mutazione. Nella terza famiglia (Famiglia C) l’analisi di linkage ha escluso il coinvolgimento del gene VWF nell’insorgenza della VWD. Successivamente mediante sequenziamento diretto, è stato escluso anche un possibile ruolo per il gene del FVIII ed è stata quindi effettuata la ricerca di un nuovo gene causativo di VWD, utilizzando simultaneamente due diversi approcci: il sequenziamento dell’intero genoma e l’analisi di linkage familiare genome-wide. I dati derivati dalle due strategie sono stati integrati e il risultato ci ha permesso di identificare ~900 variazioni a carico di 396 geni distribuiti su 4 diverse regioni di linkage (cromosoma 5, 7, 15, X). Il contributo dei geni “candidati” presenti nelle regioni di linkage è stato valutato in maniera approfondita ma fino a questo momento non è stato possibile identificare quello responsabile della patologia emorragica. Il completamento dell’analisi di questa famiglia richiede una nuova fase di sequenziamento. La quarta e ultima famiglia (Famiglia D), le cui ridotte dimensioni non hanno consentito di eseguire l’analisi di linkage, è caratterizzata da una riduzione della sopravvivenza del VWF circolante. L’evidenza che anche il VWF esogeno (da emoderivato) presentava una ridotta sopravvivenza, ha escluso il coinvolgimento del gene VWF. Il sequenziamento genico ha permesso anche di escludere il coinvolgimento dell’ADAMTS13, così come la ricerca di anticorpi anti-VWF, in un quadro di malattia autoimmune, ha dato esito negativo. In conclusione, l’utilizzo della flow-chart proposta ha permesso di caratterizzare due nuove mutazioni sul gene VWF, responsabili per le forme di VWD delle Famiglie A e B. È opportuno sottolineare che entrambe le mutazioni descritte non potevano essere rilevate con il sequenziamento standard per limiti intrinseci della tecnica, mentre il sequenziamento del mRNA suggerito dalla flow-chart ha permesso la caratterizzazione di due casi irrisolti di VWD. Nelle famiglie C e D lo studio effettuato ha invece escluso definitivamente il coinvolgimento del gene VWF, confermando l’esistenza di altri fattori/geni responsabili di VWD.

Statistiche Download - Aggiungi a RefWorks
Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Casonato, Sandra
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 26 > Scuole 26 > SCIENZE MEDICHE, CLINICHE E SPERIMENTALI > FISIOPATOLOGIA CLINICA E SCIENZE NEFROLOGICHE
Data di deposito della tesi:28 Gennaio 2014
Anno di Pubblicazione:28 Gennaio 2014
Parole chiave (italiano / inglese):von Willebrand factor, VWF, von Willebrand disease, VWD, genetics, genome sequencing, linkage analysis, cell culture
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/05 Patologia clinica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Cardiologiche, Toraciche e Vascolari
Codice ID:6483
Depositato il:07 Nov 2014 15:02
Simple Metadata
Full Metadata
EndNote Format

Bibliografia

I riferimenti della bibliografia possono essere cercati con Cerca la citazione di AIRE, copiando il titolo dell'articolo (o del libro) e la rivista (se presente) nei campi appositi di "Cerca la Citazione di AIRE".
Le url contenute in alcuni riferimenti sono raggiungibili cliccando sul link alla fine della citazione (Vai!) e tramite Google (Ricerca con Google). Il risultato dipende dalla formattazione della citazione.

Bernardi F., Marchetti G., Guerra S., Casonato A., Gemmati D., Patracchini P., Ballerini G., Conconi F. A de novo and heterozygous gene deletion causing a variant of von Willebrand disease. Blood. 1990 Feb 1;75(3):677-83. Cerca con Google

Bernardi F., Marchetti G., Casonato A., Gemmati D., Patracchini P., Legnani C., DeRosa V., Girolami A., Conconi F. Characterization of polymorphic markers in the von Willebrand factor gene and pseudogene. Br J Haematol. 1990 Mar;74(3):282-9. Cerca con Google

Casonato A., Pontara E., Bertomoro A.P., Zucchetto, A., Girolami, A. Type 2N von Willebrand disease due to Arg91 Gln substitution and a cytosine deletion in exon 18 of the von Willebrand factor gene. Brit. J. Haematolog. 103, 39-41, 1998. Cerca con Google

Casonato A., Pontara E., Sartorello F., Cattini M. G., Sartori M. T., Padrini R., Girolami A. Reduced von Willebrand factor survival in type Vicenza von Willebrand disease. Blood. 2002 Jan 1;99(1):180-4. Cerca con Google

Casonato A., Sartorello F., Pontara E., Gallinaro L., Bertomoro A., Grazia Cattini M., Daidone V., Szukowska M., Pagnan A. A novel von Willebrand factor mutation (I1372S) associated with type 2B-like von Willebrand disease: an elusive phenotype and a difficult diagnosis. Thromb Haemost. 2007 Dec;98(6):1182-7. Cerca con Google

Casonato A., Pontara E., Battiston M., Morpurgo M., Cattini M. G., Casarin E., Saga G., Daidone V., De Marco L. C2362F mutation gives rise to an ADAMTS13-resistant von Willebrand factor. Thromb Haemost. 2013 Jun;109(6):999-1006. Cerca con Google

Crawley J. T., de Groot R., Xiang Y., Luken B. M., Lane D. A. Unraveling the scissile bond: how ADAMTS13 recognizes and cleaves von Willebrand factor. Blood. 2011 Sep 22;118(12):3212-21. Cerca con Google

Dejana E., Lampugnani M. G., Giorgi M., Gaboli M. , Federici A. B. et al. von Willebrand factor promotes endothelial cell adhesion via àn Arg-Gly-Asp dependent mechanism. J. Cell. Biol. 109, 367-375, 1989. Cerca con Google

Favaloro E. J. and Koutts J. Laboratory assays for von Willebrand factor: relative contribution to the diagnosis of von Willebrand's disease. Pathology 29, 385-391, 1997. Cerca con Google

Haberichter S. L., Fahs S. A. Montgomery R. R. Von Willebrand factor storage and mutimerization: 2 independent intracellular processes. Blood, 96, 1808-1815, 2000. Cerca con Google

Hilbert L., Gaucher C., de Romeuf C., Horellou M. H., Vink T., Mazurier C. Leu 697-->Val mutation in mature von Willebrand factor is responsible for type IIB von Willebrand disease. Blood. 1994 Mar 15;83(6):1542-50. Cerca con Google

Hoffmann K., Lindner T. H. easyLINKAGE-Plus--automated linkage analyses using large-scale SNP data. Bioinformatics. 2005 Sep 1;21(17):3565-7. Cerca con Google

Hollestelle M. J., Thinnes T., Crain K., Stiko A., Kruijt J. K., van Berkel T. J., Loskutoff D. J., van Mourik J.A. Tissue distribution of factor VIII gene expression in vivo--a closer look. Thromb Haemost. 2001 Sep;86(3):855-61. Cerca con Google

Kokame K., Matsumoto M., Soejima K., Yagi H., Ishizashi H., Funato M., Tamai H., Konno M., Kamide K., Kawano Y., Miyata T., Fujimura Y. Mutations and common polymorphisms in ADAMTS13 gene responsible for von Willebrand factor-cleaving protease activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Sep 3;99(18):11902-7. Cerca con Google

Levy G. G., Nichols W. C., Lian E. C., Foroud T., McClintick J. N., McGee B. M., Yang A. Y., Siemieniak D. R., Stark K. R., Gruppo R., Sarode R., Shurin S. B., Chandrasekaran V., Stabler S. P., Sabio H., Bouhassira E. E., Upshaw J. D. Jr, Ginsburg D., Tsai H. M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001 Oct 4;413(6855):488-94. Cerca con Google

Lynch D. C., Zimmerman T. S., Kirby E. P., Livingston D. M. Subunit composition of oligomeric human von Willebrand factor. J. Biol. Chem 1983; 258:12757-60. Cerca con Google

Machado F. B., Duarte L. P., Medina-Acosta E. A novel informative dinucleotide microsatellite marker located on human factor VIII intron 25. Haemophilia. 2009 Mar;15(2):613-4. Cerca con Google

Machado F. B., Alves Da Silva A. F., Rossetti L. C., De Brasi C. D., Medina-Acosta E. Informativeness of a novel multiallelic marker-set comprising an F8 intron 21 and three tightly linked loci for haemophilia A carriership analysis. Haemophilia. 2011 Mar;17(2):257-66. Cerca con Google

Majerus E. M., Zheng X., Tuley E. A., Sadler J. E. Cleavage of the ADAMTS13 propeptide is not required for protease activity. J Biol Chem. 2003 Nov 21;278(47):46643-8. Cerca con Google

Mancuso D. J., Tuley E. A., Westfield L. A., Lester Mancuso T. L ,Le Beau M. M., Sorace J. M., Sadler J. E. Human von Willebrand factor gene and pseudogene: structural analysis and differentation by polymerase chain reaction. Biochemistry 30, 253-269, 1991. Cerca con Google

Marchetti G., Patracchini P., Volinia S., Aiello V., Schiavoni M., Ciavarella N., Calzolari E., Schwienbacher C., Bernardi F. Characterization of the pseudogenic and genic homologous regions of von Willebrand factor. Br J Haematol. 1991 May;78(1):71-9. Cerca con Google

Mazurier C., Jorieux S., Dieval J., Delobel J., Goudemand M. A new von Willebrand factor (vWF) defect in a patient with factor VIII (FVIII) deficiency but with normal levels and multimeric pattern of both plasma and platelet vWF. Characterization of abnormal vWF/FVIII interaction. Blood 75. 20, 1990. Cerca con Google

Mazurier C., Ribba A. S., Gaucher C., Meyer D. Molecular genetics of von Willebrand disease. Ann. Genet. 41, 34-43, 1998. Cerca con Google

Misumi Y., Oda K:, Fujiwara T., Takami N.,Tashiro H., Ikehara J. Functional expression of furin demonstrating its intracellular localization and endoprotease activity for processing of proalbumin and complement pro-C3. J. Bio1. Chem. 266, 16594-16601, 1991. Cerca con Google

Moake J. L. Thrombotic microangiopathies. N Engl J Med. 2002;347:589-600. Cerca con Google

Moll S., Lazarowski A. R., White II G. C. Giant Platelet Disorder in a Patient With Type 2B von Willebrand's Disease. American Journal of Hematology 57, 62-67, 1998. Cerca con Google

Nishino M., Girma JR, Rothschild C., Fressinaud E., Meyer D. New Variant of von Willebrand Disease with the Defective Binding to Factor VIII. Blood 74, 1S91-1S99, 1989. Cerca con Google

Nolan T., Hands R. E., Bustin S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 2006;1(3):1559-82. Cerca con Google

Pagliari M. T., Baronciani L., Garcìa Oya I., Solimando M., La Marca S., Cozzi G., Stufano F., Canciani M. T., Peyvandi F. A synonymous (c.3390C>T) or a splice-site (c.3380-2A>G) mutation causes exon 26 skipping in four patients with von Willebrand disease (2A/IIE). J Thromb Haemost. 2013 Jul;11(7):1251-9. Cerca con Google

Plow E. F., Srouji A. H., Meyer D., Marguerie G., Ginsberg M. H. Evidence that three adhesive proteins interact with a common regnition site on activated platelets. J. Biol. Chem. 256, 5388-91, 1984. Cerca con Google

Ruggeri Z. M., Zimmerman T.S. von Willebrand factor and von Willebrand disease. Blood 70, 895-904, 1987. Cerca con Google

Ruggeri Z. M. Pathogenesis and Classification of von Willebrand Disease. Haemostasis 24, 26S-27S, 1994. Cerca con Google

Sadler J. E. Biochemistry and genetics of von Willebrand Factor. Ann. U. Rev. Biochem. 67, 395-424, 1998. Cerca con Google

Sadler J. E. New concepts in von Willebrand disease. Annu Rev Med 2005; 56: 173-91. Cerca con Google

Sadler, J. E., Budde, U., Eikenboom, J. C. J., Favaloro, E. J., Hill, F. G. H., Holmberg, L., Ingerslev, J., Lee, C. A., Lillicrap, D., Mannucci, P. M., Mazurier, C., Meyer, D., Nichols W. L., Nishino M., Peake I. R., Rodeghiero F., Schneppenheim R., Ruggeri Z. M., Srivastava A., Montgomery R. R., Federici A. B. Update on the pathophysiology and classification of von Willebrand disease: a report of the Subcommittee on von Willebrand Factor. J. Thromb. Haemost. 4: 2103-2114, 2006. Cerca con Google

Schneppenheim, R., Federici, A. B., Budde, U., Castaman, G., Drewke, E., Krey, S., Mannucci, P. M., Riesen, G., Rodeghiero, F., Zieger, B., Zimmermann, R. Von Willebrand disease type 2M “Vicenza” in Italian and German patients: identification of the first candidate mutation (G3864A; R1205H) in 8 families. Thromb. Haemost. 82: 136-140, 2000. Cerca con Google

Spom L. A., Marder V. J., Wagner D. V. Inducible secretion of large, biologically potent von Willebrand factor multimers. Cell 46, 186, 1986. Cerca con Google

Tsai H. M. Type 2A (group II) von Willebrand disease mutations increase the susceptibility of VWF to ADAMTS-13. J Thromb Haemost. 2004 Nov;2(11):2057. Cerca con Google

Vischer U. M. and Wagner D. D. von Willebrand Factor Proteolytic Processing and Multimerization Precede the Formation of Weibel-Palade Bodies. Blood 83, 3536-44, 1994. Cerca con Google

Wagner D. D., Marder V. J. Biosynthesis of von Willebrand protein by human endothelial cells: Identifications of a large precursor polypeptide chain. J. Biol. Chem. 258, 2065-67, 1983. Cerca con Google

Wise R. J., Pittman D. D., Handin R. L, Kaufman R. J., Orkin S. H. The Propeptide of von Willebrand Factor Independently Mediates the Assembly of von Willebrand Multimers. Ce1152, 229-236, 1988. Cerca con Google

Zanardelli S., Crawley J. T., Chion C. K., Lam J. K., Preston R. J., Lane D. A. Adamts13 substrate recognition of von Willebrand factor A2 domain. J Biol Chem. 2005 Oct 12. Cerca con Google

Zaverio M., Ruggeri, Waxe J. The Structure and Function of von Willebrand Factor. Thromb. Haemost.67, 594-599, 1992. Cerca con Google

Zhang X., Halvorsen K., Zhang C. Z., Wong W. P., Springer T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 2009 Jun 5;324(5932):1330-4. Cerca con Google

Zheng X., Chung D., Takayama T. K., Majerus E. M., Sadler J. E., Fujikawa K. Structure of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13), a metalloprotease involved in thrombotic thrombocytopenic purpura. J Biol Chem. 2001: 276.41059-41063. Cerca con Google

Download statistics

Solo per lo Staff dell Archivio: Modifica questo record