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Fernandez, Julian (2014) Study of the mechanism of action of snake myotoxins. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Envenoming due to snake bite is a neglected disease that is a very important public health problem in rural regions of Africa, Latin America and Asia. Snakes from the genus Bothrops cause most of the snake bites in Latin America. Phospholipases A2 (PLA2s) are major components of the venoms from this genus, exerting myotoxicity as one of their most relevant toxic actions. Many parts of the mechanism of action by which these proteins damage muscle cells are not known. Therefore, it is crucial to further study these toxins.
In the first part of this work, the measurement of the hydrolysis of phospholipids caused by the addition of myotoxin I (Mt-I) and myotoxin II (Mt-II) from the venom of Bothrops asper to C2C12 myotubes, and the ex vivo injection of the venom of B. asper, Mt-I, and Mt-II in tibialis anterior muscles of CD-1 mice was performed. Results show that Mt-I and B. asper venom caused an increase in lysophosphatidilcholine (lysoPC) and lysophosphatidilethanolamine (lysoPE) species, while Mt-II generated no significant production of lysophospholipids of any of these species. These results show for the first time that Mt-I and B. asper venom are able to hydrolyze phospholipids when injected in muscles. Their main products of hydrolysis are lysoPC and lysoPE, and their proportions indicate that the main site of action of Mt-I is the external part of the plasma membrane. Mt-II, which causes Ca2+ entry into muscle cells, does not cause a significant activation of the endogenous PLA2s in injected muscles.
ATPase, ADPase and nucleotidase activities of B. asper venom were quantified in the second part, and the role of these activities in venoms containing myotoxins was analyzed. Since myotoxins release ATP in cultured myotubes as well as in vivo, there is a combined action with ATPase, ADPase and nucleotidase activities in the venom that creates a high concentration of adenosine, which has hypotensive, paralyzing and anti-coagulant activities.
In the third part, which contains the ongoing experiments, a conjugation reaction of Mt-I with peptide derivatives using a transglutaminase enzyme has been developed. Mt-I was modified in a single amino acid, with a good percentage of catalytic and toxic activity still present. The aim is to obtain a Mt-I conjugated to a fluorophore to study the localization of the toxin in cultured myotubes or when injected in mouse tibialis anterior muscles. Subsequently, Mt-I will be conjugated to a biotin derivative as a tag to isolate the toxin after cell intoxication together with interacting proteins or other molecules

Abstract (italiano)

Gli avvelenamenti da morso di serpente costituiscono un problema molto importante di sanità pubblica nelle regioni rurali di Africa, America Latina e Asia. I serpenti del genere Bothrops sp. sono la causa della maggior parte dei morsi di serpente in America Latina. Le fosfolipasi A2 (PLA2s) sono parte dei principali componenti dei veleni di questo genere, e la miotossicità è uno dei loro effetti tossici più importanti. Il meccanismo d’azione con cui queste proteine danneggiano le cellule muscolari non è ancora stato del tutto chiarito.
Nella prima parte di questo lavoro, è stata fatta un’analisi in spettrometria di massa dei prodotti da idrolisi causati dall’intossicazione con miotossina I (Mt-I) e miotossina II (Mt-II) di Bothrops asper utilizzando miotubi C2C12 in cultura, e dall’iniezione ex vivo di Mt-I, Mt-II e veleno di B. asper nei muscoli tibialis anterior di topi CD-1. La Mt-I e il veleno di B. asper hanno indotto un aumento consistente di lisofosfatidilcolina (lysoPC) e lisofosfatidiletanolamina (lysoPE) nei campioni analizzati. Invece, la Mt-II non ha alterato significativamente la concentrazione di nessun fosfolipide. Questi risultati mostrano per la prima volta che la Mt-I e il veleno di B. asper causano una produzione significativa di lisofosfatidilcolina e lisofosfatidiletanolamina quando vengono iniettati nel muscolo. I prodotti principali della loro azione sonno lysoPC e lysoPE, e la proporzione di idrolisi di fosfatidilserina e questi due lipidi indica che il sito principale d’azione de la Mt-I è la parte esterna della membrana plasmatica. La Mt-II anche se induce una entrata di calcio dentro alle cellule muscolari non provoca un’attivazione significativa delle fosfolipasi endogene.
Nella seconda parte, è stata quantificata l'attività ATPasica, ADPasica e nucleotidasica dal veleno di B. asper, ed è stato analizzato il ruolo di queste attività nei veleni di serpenti contenenti miotossine. Partendo dal fatto che le miotossine inducono il rilascio di ATP in vivo, la presenza di nucleotidasi nel veleno porta ad una elevata concentrazione di adenosina in circolo, che ha attività ipotensiva, paralizzante e anticoagulante.
Nella terza parte è stata messa a punto una reazione enzimatica di coniugazione della Mt-I con un derivato peptidico tramite l'enzima transglutaminasi. La reazione di coniugazione ha permesso di ottenere la tossina con una modifica ad un singolo amino acido e, dai primi esperimenti di caratterizzazione, con attività tossica e fosfolipasica ancora presenti. Lo scopo finale è di coniugare la Mt-I con un fluoroforo, per studiare la localizzazione della tossina quando viene aggiunta ai miotubi in cultura o iniettata nei muscoli tibialis anterior di topi. Successivamente di coniugare la tossina con un derivato della biotina per isolare dalle cellule le proteine od altre molecole interagenti con essa

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Montecucco, Cesare
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 26 > Scuole 26 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > BIOLOGIA CELLULARE
Data di deposito della tesi:29 Gennaio 2014
Anno di Pubblicazione:29 Gennaio 2014
Parole chiave (italiano / inglese):myotoxins, snake venom, phosphlipases A2
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/10 Biochimica
Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Biomediche
Codice ID:6569
Depositato il:13 Nov 2014 09:21
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