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Casari, Alessandro (2014) In vivo analyses of morphogen signalling pathways using Zebrafish transgenic reporter lines. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Cells movements and cell fate decision occurring during embryonic development are ruled by several chemical signals genetically encoded. Some of them are known as morphogens, because they create a gradient along the embryo and stimulate a different cell response depending on the concentration detected by each cell. BMP, TGFb, Wnt and Shh are actually recognized as chemical signals acting as morphogens. In the responsive cells, these extracellular signals trigger a signal transduction pathway that leads to the activation of specific transcription factors. In adult, they are also important to maintain the tissue homeostasis and to regulate the regeneration processes. It has been demonstrated that their deregulation is associated to some diseases, such as cancer and some pathologies associated to an altered inflammatory response.
Zebrafish can be a useful tool to study these pathways. The transparency of the embryo and the external fertilization that make possible both chemical and genetic manipulations are some of the advantages of this experimental model. Our lab has developed some transgenic reporter lines to study in vivo morphogens signalling. The aim of this thesis has been to characterize and validate these reporter lines, especially the smad3/TGFb-responsive line.
After having demonstrated that these lines are faithfully responsive to the correspondent pathway, they have been used for two main projects:
- to understand the role of smad3 during the central nervous system (CNS) development
- to study the interaction occuring among the morphogens together with Notch and FGF signalling in early larval development
It has been demonstrated that smad3-associated reporter expression is localized in the inner part of the CNS, where neural progenitor cells are situated. Notably, colocalization measurment with reporter genes expressed in various neural markers have demonstrated that smad3 is active in both glial and neuronal precursor cells. Furthermore, both chemical inhibition and smad3 knock-down cause a decrease of precursors accompanied to an increase of progenitor, and a reduction of mature cells, such as motor neurons and oligodendrocytes. EdU proliferation assay has confirmed that smad3 is active in post-mitotic, non proliferating cells and smad3/TGFb inhibition leads to an increase of cell proliferation and an altered epithelial-to-mesenchymal transition that can be responsible of the observed motor neuron misalignment. Both Zebrafish smad3 paralogues, smad3a and 3b, seem to play a similar role in the CNS development as knock-down of each isoform impairs neural differentiation.
To study epistatic interactions, reporter lines embryos have been treated at 24 hpf with drugs specifically acting on the 4 studied morphogen pathways, Notch and FGF signalling. The effects of treatments have been initially recorded with the epifluorescent microscope. Results have been associated to those inferred by GFP mRNA in situ hybridization performed on the reporter larvae treated with the same drugs as before. To have reliable data, fluorescence levels have been quantified for each group of treatment through ImageJ software. Results obtained have been used to infer possible interactions among the observed chemical signals at early larval development. A confocal analysis of double reporter transgenic larvae has confirmed the relative expression of the signalling pathways.
As a further demonstration of the possibility of an in vivo use of Zebrafish transgenic lines, a preliminary study concerning the role of morphogens on pancreas development has been performed. Crossing the morphogens lines with transgenics expressing a reporter gene in endocrine or exocrine pancreas, in either progenitors or precursors, it has been possible to reveal a new involvement of Shh signalling in the pancreatic islet at early larval development and the activity of BMP pathway in pancreatic vasculature, where it seems to play a role in the correct positioning of the main islet and control angiogenesis, as demonstrated by functional studies.
In conclusion, the morphogen reporter lines here described can represent interesting experimental models in different biological fields. They permit to follow dynamic processes both in physiological and pathological conditions in vivo. They are faithfully responsive to the studied signalling and can be a complementary tool to the current in vitro studies.

Abstract (italiano)

Diversi segnali chimici regolano il direzionamento delle cellule e il loro differenziamento durante lo sviluppo embrionale. Alcuni di questi vengono definiti come morfogeni, perché agiscono creando un gradiente nell'embrione e determinano una risposta diversa nelle cellule a seconda della concentrazione percepita. BMP, TGFb, Wnt e Shh sono riconosciuti come morfogeni. Nelle cellule che ricevono uno di questi segnali si attiva una cascata trasduzionale che termina con l'attivazione di specifici fattori di trascrizione. Questi segnali svolgono un ruolo importante anche negli adulti, controllando i processi di rigenerazione e mantenendo l'omeostasi dei tessuti. E' noto che una loro alterazione è associata a malattie di vario tipo, come il cancro e patologie con una risposta infiammatoria anomala. Lo zebrafish può essere un utile strumento per lo studio di questi segnali. La trasparenza degli embrioni e la fecondazione extra-utero ne rende possibile la manipolazione genetica e chimica. Il nostro laboratorio ha sviluppato alcune linee reporter per lo studio di questi morfogeni. Lo scopo di questa tesi è stato prima di tutto validare e caratterizzare queste linee, soffermandoci in particolare sulla linea responsiva al TGFb/smad3.
Dopo la loro validazione, queste linee sono state impiegate per lo sviluppo di 2 progetti:
- la comprensione del ruolo dello smad3 nello sviluppo del sistema nervoso centrale
- la comprensione delle interazione trai 4 citati morfogeni e le vie di segnale del Notch e del FGF durante lo sviluppo larvale precoce
E' stato dimostrato che l'espressione del reporter legata allo smad3 si localizza principalmente nel parte più interna del sistema nervoso. Studi di colocalizzazione hanno mostrato che il reporter è espresso da cellule gliali e neuronali che stanno differenziando. Inoltre, sia l'inibizione chimica sia il knock-down dello smad3 causano un aumento dei progenitori accompagnato da una diminuzione dei precursori e di cellule mature come i motoneuroni e gli oligodnedrociti.
Il saggio di proliferazione con l'EdU ha mostrato che il reporter è espresso in cellule post-mitotiche non proliferanti. L'inibizione del smad3/TGFb porta a un aumento delle cellule proliferanti e altera il processo di transizione da epiteliale a mesenchimale che può essere responsabile dell'errato posizionamento dei motoneuroni.
Inoltre, entrambi i paraloghi dello smad3, smad3a e b, trovati in zebrafish, sembrano avere un simile ruolo nel regolare il differenziamento neurale come dimostrato dall'effetto similare determinato dal knock-down di entrambi.
Per studiare le interazione trai segnali chimici le corrispondenti linee reporter sono state trattate a 24 hpf con le molecole che agiscono in modo specifico su ciascuno di essi. Gli effetti sull'espressione del reporter sono stati innanzitutto valutati al microscopio a fluorescenza. Questi risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti con l'analisi del trascritto della GFP tramite ibridazione in situ. Per ottenere dei dati oggettivi, la fluorescenza è stata quantificata con il software ImageJ. I risultati ottenuti hanno permesso di ricavare uno schema di interazioni trai segnali chimici durante lo sviluppo larvale precoce. L'analisi al microscopio confocale ha permessso l'analisi d'espressione temporale e spaziale reciproca delle varie vie di segnale.
Come ulteriore dimostrazione dell'applicazione in vivo delle linee transgeniche, è stato effettuato uno studio preliminare del ruolo dei morfogeni nello sviluppo del pancreas.
Incrociando le linee reporter prima descritte con transgenici esprimenti un reporter nel pancreas endocrino o esocrino, in precursori o cellule mature, è stato possibile rilevare il coinvolgimento del Shh nello sviluppo dell'isola pancreatica e l'attivazione del BMP nel sistema vascolare pancreatico, dove sembra coinvolto nel controllo dell'angiogenesi e nel corretto posizionamento dell'isola stessa, come dimostrato dagli studi funzionali.
In conclusione, le linee qui illustrate rappresentano un nuovo e interessante modello per la ricerca in diversi campi biologici. Consento di seguire processi dinamici sia in condizioni fisiologiche sia patologiche in vivo. Inoltre sono perfettamente responsive ai segnali per cui sono state create e possono complementare gli studi in vitro.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Argenton, Francesco
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 26 > Scuole 26 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > GENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE DELLO SVILUPPO
Data di deposito della tesi:30 Gennaio 2014
Anno di Pubblicazione:30 Gennaio 2014
Parole chiave (italiano / inglese):zebrafish/reporter lines/morphogens
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/18 Genetica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:6696
Depositato il:05 Nov 2014 14:24
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