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wong, andrea kuan cie (2014) Single organelle fret-based analysis of intracellular calcium: different effects of presinilis carrying Familial Alzheimer's Disease mutations. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Calcium (Ca2+) is one of the major intracellular messengers that impacts nearly every aspect of cell life. In particular, it plays essential roles in neuronal development, synaptic transmission and plasticity, as well as in the regulation of metabolic pathways and cell fate decisions.
The first goal of my work was to study more in details the Golgi apparatus (GA), as an intracellular Ca2+ store.
The Golgi complex may store up to 5% of the total cellular Ca2+ at higher concentrations and contains several different luminal Ca2+-binding proteins and Ca2+-release channels. The use of a specific Cameleon Ca2+ sensor targeted to the trans-Golgi, allowed us to directly demonstrate the functional GA heterogeneity by showing the distinct behaviour of this sub-compartment: it takes up Ca2+ almost exclusively via SPCA1 (and not by SERCA); it does not release Ca2+ in response to IP3 generation, but rather accumulates the cation as a consequence of the cytoplasmic Ca2+ rise.
Using a novel GFP-based Ca2+ probe selectively localized to the medial-Golgi (mGo-D1cpV), we have demonstrated that this sub-compartment behaves in a unique way, releasing Ca2+ upon cell stimulation not only with IP3-generating agonists, but also through Ryanodin receptors (RyRs) and relying, for its Ca2+ uptake, on both SERCA and SPCA1 pumps.
The GA represents, thus, an intracellular Ca2+ store with an high complexity level. In a space of a few microns and despite its continuous inter-mixing dynamics, the Ca2+ toolkit undergoes major changes and distinct, separate functional sub-regions, with different Ca2+ features, contribute to its Ca2+ handling.
The second aim of my work was to study, at the single cell level by employing specifically targeted cameleon Ca2+ probes, the effect of Familial Alzheimer'€™s Disease (FAD) presenilin 1 and 2 (PS1, PS2) mutants on Ca2+ homeostasis in different sub-cellular compartments: the endoplasmic reticulum (ER), the medial and trans-Golgi.
Ca2+ dyshomeostasis has been demonstrated in AD, in particular in the rare genetically inherited FAD cases (mostly due to mutations in PS1 and PS2 genes).
In our lab has been recently shown, by employing an ER-targeted aequorin Ca2+ sensor at the cell population level, that FAD-PS2 mutants reduce the Ca2+ content of the major intracellular Ca2+ store, the ER, mostly by inhibiting SERCA activity.
In order to deeper investigate the effect of the expression of FAD-PS mutants on ER Ca2+ handling in single cell FRET-experiments, we created a novel ER-targeted cameleon Ca2+ probe (ER-D4) with optimized Ca2+ affinity and dynamic range. In addition, the new cameleon Ca2+ probe targeted to the medial-Golgi, above described, was also used for a similar purpose.
Ca2+ handling by the distinct intracellular compartments, at single cell level, was evaluated in SHSY5Y cell line over-expressing PS2 wild type (wt), FAD-PS2-T122R, PS1 wt or FAD-PS1-A246E and also in human fibroblasts from a FAD-PS2-N141I and a FAD-PS1-A246E patient (and corresponding controls from individuals of the same age and sex).
Ca2+ concentration ([Ca2+]) of the ER and the medial-Golgi, in resting cells, is strongly reduced by PS2, but not PS1, mutants expression, while that of the trans-Golgi compartment results unaffected by both mutants.
The Ca2+ uptake rate in these stores is reduced by PS2 mutants expression and, only within the medial-Golgi, also the Ca2+ leak rate is potentiated.
These findings strength our previous data showing the inhibitory effect of FAD-PS2 on SERCA activity. They are also consistent with the fact that, within the Golgi, only the medial-compartment is endowed with IP3 receptors and SERCA pumps, whereas the trans-Golgi is devoid of both.
In conclusion, the data highlight the molecular heterogeneity of different intracellular Ca2+ stores (and in distinct sub-compartments of the same organelle) and provide new insights for the comprehension of the mechanisms through which PSs influences cellular Ca2+ homeostasis and FAD pathogenesis.
In the future, these cameleon probes will be applied to study Ca2+ alterations induced by FAD-PS2 mutations and, eventually, in vivo by means of viral vectors.

Abstract (italiano)

Il Calcio (Ca2+) è uno dei principali messaggeri intracellulari coinvolto quasi in tutti gli aspetti della vita cellulare. In particolare, il Ca2+ gioca un ruolo essenziale nello sviluppo neuronale, plasticità e trasmissione sinaptica, come anche nella regolazione delle vie metaboliche e dell’apoptosi.
Il primo obbiettivo del mio lavoro è stato studiare in dettaglio l’apparato di Golgi (AG) come riserva intracellulare di Ca2+.
Il complesso del Golgi può contenere più del 5% della totalità del Ca2+ cellulare a concentrazioni significativamente maggiori che in altre regioni cellulari. L’apparato del Golgi contiene tipicamente anche una moltitudine di proteine leganti Ca2+ e canali per il Ca2+. L’uso di una sonda cameleon specificamente indirizzata al trans-Golgi, ci ha permesso di dimostrare direttamente l'eterogeneità funzionale dell’AG mettendo in luce le caratteristiche distinte di questo subcompartimento : l’accumulo di Ca2+ avviene esclusivamente tramite SPCA1 (e non tramite SERCA); inoltre, in risposta a generazione di IP3 non c’è rilascio di Ca2+, ma un suo piccolo accumulo come conseguenza dell’aumento di Ca2+ citosolico.
Usando una nuova sonda per il Ca2+ basata sulle GFP selettivamente indirizzata nel cis/medial-Golgi, (mGo-D1cpv), abbiamo dimostrato che il medial-Golgi si comporta in una maniera unica, rilasciandolo Ca2+ dopo stimolazione non solo di agonisti liberanti IP3, ma anche attraverso il recettore rianodinico (RyR) e basandosi, per l’accumulo di Ca2+, sia sulla SERCA che su SPCA1.
In conclusione, l’AG rappresenta uno store intracellulare di Ca2+ con un alto grado di complessità . In uno spazio di pochi micron e nonostante il suo continuo intermescolamento dei vari subcompartimenti, il set di proteine che regolano l’omeostasi Ca2+ cambia in maniera consistente, separando sub-regioni funzionali, con differenti proteine regolanti il Ca2+, contribuendo alla sua omeostasi.
Il secondo obbiettivo del mio lavoro è stato studiare in dettaglio, utilizzando sonde cameleon specificamente indirizzate, l’effetto di mutazioni familiari del morbo di Alzheimer (FAD) nei geni delle preseniline (PSs) 1 e 2.
Nel nostro laboratorio è stato recentemente visto che la mutazione FAD PS2 riduce il contenuto di Ca2+ del principale store cellulare: il reticolo endoplasmatico (RE), principalmente inibendo l'attività della SERCA, come dimostrato a livello di popolazione cellulare utilizzando la sonda Ca2+ equorina indirizzata al RE.
Per studiare l’effetto dell’espressione delle mutazioni FAD sull’omeostasi del Ca2+ nel RE in esperimenti FRET su singola cellula, abbiamo creato la nuova sonda cameleon indirizzata al RE (ERD4) con ottimizzate affinità al Ca2+ e range dinamico.
L’omeostasi del Ca2+ nei diversi subcompartimenti, a livello di singola cellula, sono stati studiati nella linea cellulare SH-SY5Y sovra-esprimendo PS2 wild type (wt), PS2-T122R, PS1 wt opppure PS1-A246E, e anche in fibroblasti umani da pazienti FAD-PS2-N141I e FAD-PS1-A246E (con i rispettivi fibroblasti di controllo da controlli sani della stessa età e sesso).
La concentrazione di Ca2+ ([Ca2+]) di RE e medial-Golgi, in cellule a riposo, è fortemente ridotta dalle PS2 mutate o wt (quest’ultima solo in sovra-espressione), ma non dalla PS1 mutata. Nel trans-Golgi, invece, la [Ca2+] in cellule a riposo risulta non essere alterata in nessun caso.
Inoltre, il tasso di accumulo di Ca2+ in questi stores viene ridotto dalle PS2 mutate o wt (quest’ultima solo in sovra-espressione) e, solo nel medial-Golgi, il tasso di fuoriuscita del Ca2+ è potenziata. Questi risultati rafforzano la nostra ipotesi di un effetto inibitorio da parte della PS2 mutata sull'attività della SERCA. Tali risultati sono anche consistenti con il fatto che, all’interno del Golgi, solo il compartimento cis/medial ha il recettore IP3 e la pompa SERCA, mentre il trans-Golgi è mancante di entrambi.
In conclusione, i nostri dati fanno luce sull'eterogeneità molecolare di diversi store intracellulari per il Ca2+ (e in distinti subcompartimenti dello stesso organello) e aggiungono nuovi dettagli per comprendere i meccanismi attraverso cui le PSs influenzano l’omeostasi del Ca2+ e la patogenesi delle FAD.
In prospettiva futura, queste sonde cameleon saranno utilizzate per studiare alterazioni sull’omeostasi del Ca2+ indotte da mutazioni FAD-PS2 e, eventualmente, in vivo utilizzando vettori virali.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Pozzan, Tullio - Pizzo, Paola
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 26 > Scuole 26 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > BIOLOGIA CELLULARE
Data di deposito della tesi:30 Gennaio 2014
Anno di Pubblicazione:30 Gennaio 2014
Parole chiave (italiano / inglese):Presenilin, Calcium, Calcium homeostasis, Alzheimer, Endoplasmic reticulum, Golgi, cameleon calcium probe,
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/04 Patologia generale
Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Biomediche
Codice ID:6770
Depositato il:31 Ott 2014 13:39
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