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Guha, Rusha (2014) Integrated analysis of mRNA and miRNA in human differentiating muscle cells. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Muscles are responsible for the movement of body and take up roughly half of the person’s body weight. Skeletal muscles are the only voluntary muscle tissue in human body, being controlled consciously.
Skeletal muscle cells form when many smaller progenitor cells lump themselves together to constitute long, straight, multinucleated fibers. The proliferating muscle cells are called myoblasts. Myoblasts fuse together to form multinucleated non-proliferating cells called myotubes. The transition from proliferative to differentiated state involves a complete shift of the cell’s transcriptome based on a network of regulation at the molecular level. To uncover the intricacies of molecular activities involved in the process of muscle differentiation it is essential to have deeper and through understanding of the transcriptome in its entirety. RNA seq, which is a high through put sequencing technology, gives us the opportunity to reach into the deepest level of the transcriptome.
By means of the RNA seq technology I obtained the in-depth view of the transcriptome of human muscle cells from the proliferative to the differentiated stage. The analysis was extended also to small RNAs, to have a full picture of the transcriptome. I performed the analysis with the specific objectives of identifying the expressed genes and finding out differential gene expression, of both mRNA and miRNA. I also investigated the crosstalk between mRNA and miRNA, employing two separate methods : miRNA over expression and Ago2 immunoprecipitation followed by RNA seq.
The over expression experiments were carried out with 5 different miRNAs and in all cases I found more genes turned up than turned down. These results suggest that miRNA might either have a role in mRNA stabilization or it could play a part in a double negative mechanism by inhibiting some negative factor. By comparing the genes down regulated after miRNA over expression with Ago2-enriched genes we have found several candidate genes which are most likely under the down regulatory control of miRNA.
Skeletal muscle has enormous plasticity and can endure a lot of stress. To study this aspect of muscle we performed mechanical stretch of differentiating muscle cells. With RNA seq we got the in-depth view of the transcriptome as a response to stretch. We performed the analysis at two time points after stretch and found that stretch triggered immune response genes soon after, but enhanced muscle structural-protein genes expression over a prolonged course of time when the immune response takes a back seat.
I believe that our thorough transcriptome analysis, including miRNA and mRNA interaction studies during myogenesis, contributes towards the better understanding of the process regulating muscle development

Abstract (italiano)

I muscoli sono responsabili dei movimenti del corpo e costituiscono circa metà del peso di una persona. I muscoli scheletrici sono i soli tessuti muscolari volontari, essendo controllati coscientemente.
Le cellule del muscolo scheletrico si formano quando diverse piccole cellule progenitrici si conglobano tra loro per formare lunghe affusolate fibre multinucleate. Le cellule muscolari proliferanti sono chiamate mioblasti. I mioblasti si fondono tra loro per formare cellule multinucleate e non proliferanti, chiamate miotubi. La transizione dallo stato proliferante a quello differenziato implica un completo cambiamento del trascrittoma cellulare, basato su una rete di regolazione a livello molecolare. Per scoprire il groviglio di attività molecolari implicate nel processo di differenziamento muscolare è essenziale avere una più profonda ed estesa comprensione del transcrittoma nella sua interezza. L'RNA seq è una tecnologia di sequenziamento massivo che ci offre l'opportunità di accedere ai livelli più approfonditi del trascrittoma.
Con la tecnologia dell'RNA seq ho ottenuto una precisa visione del trascrittoma delle cellule muscolari umane, sia allo stadio proliferativo che a quello differenziato. Per avere una visione completa del trascrittoma, l'analisi è stata estesa anche agli small RNA. Ho svolto queste analisi con l'obiettivo specifico di identificare i geni espressi e di evidenziare in particolare quelli differenzialmente espressi, sia per quanto riguarda gli mRNA che i miRNA. Ho anche analizzato il crosstalk tra mRNA e miRNA, impiegando due diversi metodi: sovraespressione dei miRNA e immunoprecipitazione di Ago2, seguita da RNA seq.
Gli esperimenti di sovraespressione sono stati condotti con 5 diversi miRNA e in tutti i casi ho trovato più geni che hanno aumentato il loro livello piuttosto di geni che l'hanno diminuito. Questi risultati suggeriscono che i miRNA potrebbero avere un ruolo nella stabilizzazione degli mRNA, oppure potrebbero avere un ruolo in un doppio meccanismo negativo, inibendo a loro volta fattori negativi. Confrontando i geni che diminuiscono di livello dopo la sovraespressione di miRNA con i geni arricchiti dall'immunoprecipitazione con Ago2, abbiamo trovato diversi geni candidati per essere sotto il controllo inibitorio dei miRNA.
Il muscolo scheletrico ha una grande plasticità e può sopportare un notevole stress. Per studiare questo aspetto del muscolo abbiamo sottoposto le cellule in differenziamento a stiramento meccanico. Con l'RNA seq abbiamo ottenuto un'approfondita visione del trascrittoma in risposta allo stiramento. Abbiamo effettuato queste analisi a due diversi tempi dopo lo stiramento ed abbiamo trovato che nel periodo immediatamente successivo allo stimolo vengono sovraespressi geni implicati nella risposta immunitaria, mentre successivamente sono attivati i geni codificanti proteine muscolari strutturali, quando allo stesso tempo la risposta immunitaria viene inibita.
Sono convinta che la nostra approfondita analisi del trascrittoma che include l'interazione di mRNA e miRNA durante la miogenesi, possa contribuire ad una maggiore comprensione di processi che regolano lo sviluppo muscolare

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Valle, Giorgio
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 26 > Scuole 26 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > BIOTECNOLOGIE
Data di deposito della tesi:30 Gennaio 2014
Anno di Pubblicazione:30 Gennaio 2014
Parole chiave (italiano / inglese):skeletal muscle, RNA seq, miRNA seq, transcriptome
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:6796
Depositato il:14 Nov 2014 12:10
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