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Catapano, Francesco (2015) Detection of circulating miRNAs in serum in a mouse model of Collagen VI deficiency. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Collagen VI is the main extracellular matrix (ECM) protein synthesized and secreted mainly by fibroblasts that forms a structurally network of microfilaments.
Collagen VI binds several cell surface receptors and ECM components, suggesting that collagen VI is an important mechanical link between muscle cells and surrounding ECM. [1]
Mutations related to COL6A1, COL6A2 and COL6A3 genes encoding for the three main collagen VI chains, cause the collagen VI-related myopathy, a specific subtype of congenital muscular dystrophy (CMD).
In particular Ullrich congenital muscular dystrophy (UCMD) is a severe form characterized by progressive muscle wasting leading to loss of ambulation around ten years of age and respiratory problems in late childhood or young adulthood.
Bethlem Miopathy (BM) is a mild-form characterized by a slow course usually without respiratory symptoms where around 50% of patients lose ambulation in the fifth decade. [2]
Being the genetic test aimed to find mutations in COL6A genes expensive and time consuming mainly because the large size of the three genes, (106 coding exons in total [2]) the diagnosis of collagen VI-related myopathies is based on the clinical signs assessment coupled to the muscular biopsy which is useful to highlight any dystrophic or myopathic changes in the muscle fibers of the patient.
The aim of the present work has been to identify a panel of miRNAs significantly dysregulated in col6a1-/- mice, the animal model of Bethlem myopathy and Ullrich congenital muscular dystrophy.
miRNAs represent an ideal biomarker because they are easy to detect, well preserved in serum and non invasive.
The findings of this work can be translated, in a further step, in a cohort of affected patients in order to become a powerful tool for the diagnosis and the follow-up of collagen VI-related myopathy.

Research projects aimed to link the differential miRNA expression to pathological conditions are increasing and this suggests how miRNAs could be used as powerful tool to track disease related changes on a large scale in the forthcoming years.
In order to identify differentially expressed miRNAs in knock-out col6a1-/- (KO) mice serum, a miRNAs expression profiling analysis by SYBR Green-based real-time PCR of 752 miRNAs in 5 col6a1+/+(WT) and 6 col6a1-/- has been performed.
Fifty one (6.5%) of the 333 miRNAs expressed in col6a1-/- mice serum, showed a significant dysregulation between col6a1-/- and WT mice serum.
The statistical analysis revealed 17/51 miRNAs up-regulated and 34/51 down-regulated.
To further characterized the dysregulated miRNAs we checked their involvement in disease related pathways coupled with literature analysis.
These analyses showed that mmu-miR-195a-5p, mmu-miR-26a-5p, mmu-let-7c-5p and mmu-let-7b-5p are up-regulated in col6a1-/- mice serum, whereas mmu-miR-29b-3p and mmu-miR-29a-3p are downregulated ofd of. These observations are quite interesting because these miRNAs could play an important role in the collagen VI-related myopathies linking genes involved in essential signalling pathway for skeletal muscle cells development, differentiation or coding for ECM proteins.
In particular miRNAs targets interfere with ERBb, MAPK, PIK3/Akt, mTOR, ECM-receptors, actin cytoskeleton, focal adhesion and calcium signalling.
In conclusion, this project has identified 6 dysregulated microRNAs (mmu-miR-195a-5p, mmu-miR-26a-5p, mmu-let-7c-5p, mmu-let-7b-5p, mmu-miR-29b-3p and mmu-miR-29a-3p) that could be used in future studies as biomarkers and possibly as a tool for the diagnosis and the follow-up of collagen VI-related myopathies.
Further analyses in larger cohorts of BM and UCMD patients are needed in order to validate the data obtained in mice models.

Abstract (italiano)

Il collagene VI, sintetizzato e secreto principalmente da fibroblasti, è uno dei maggiori costituenti della matrice extracellulare (ECM) ove forma una fitta rete di microfilamenti.
Questa proteina prende contatto con diversi recettori localizzati sulla membrana cellulare e allo stesso tempo con altri componenti della matrice extracellulare indicando che, probabilmente, il
collagene VI ha un ruolo importante nella trasmissione dei segnali tra l’interno e l’esterno della cellula oltre che una funzione puramente strutturale.[1]
Mutazioni legate ai geni COL6A1, COL6A2 e COL6A3, codificanti per le catene principali del collagene VI, causano
la distrofia muscolare congenita di Ullrich (UCMD) e la variante mite, miopatia di Bethlem (BM).
La UCMD è una forma severa di distrofia muscolare caratterizzata da un deficit di forza progressivo che porta, nella maggior parte dei pazienti, alla perdita della deambulazione attorno al decimo anno di vita e a problemi respiratori nella tarda adolescenza o all’inizio dell’età adulta.
La BM è una forma di miopatia meno severa rispetto alla UCMD caratterizzata da un decorso più lento e dalla assenza di insufficienza respiratoria. Circa il 50% dei pazienti con BM perde la deambulazione dopo la quinta decade. [2]
La ricerca di mutazioni nei geni COL6A1, COL6A2 e COL6A3 è una procedura costosa e complessa (la sequenza codificante dei tre geni è pari a 106 esoni [2]), e la diagnosi di collagenopatia è spesso basata sulla presentazione clinica e sulle caratteristiche della biopsia muscolare.
La biopsia muscolare è una procedura invasiva di elevato costo.
Lo scopo di questo studio è stato quello di identificare dei microRNA (miRNA) significativamente disregolati nel siero del topo col6a1-/-, modello animale di collagenopatia, per individuare un pannello di biomarcatori da poter studiare, in una fase successiva, in pazienti affetti da UCMD e BM.
I miRNA sono dei biomarcatori ideali, non invasivi, in quanto facili da dosare e stabili nel siero.
L’identificazione di biomarcatori non invasivi rappresenterà un importante strumento per la diagnosi e il follow-up delle collagenopatie.


Al fine di identificare miRNA differenzialmente espressi nel siero del topo col6a1-/- (KO) e col6a+/+ (WT), sono stati analizzati 752 diversi miRNA in 11 campioni (rispettivamente n=5 WT e n=6 KO).
333 miRNA sono risultati espressi nel siero dei topi KO ed il .
6,5%, 51 miRNA, sono risultati significativamente disregolati nel siero dei topi WT rispetto a quello dei KO (17/51 miRNAs up-regolati e 34/51 down-regolati).
I miRNA disregolati sono stati caratterizzati avvalendosi di specifiche analisi di pathway accoppiate ai dati trovati in letteratura.
I miRNAs: mmu-miR-195a-5p, mmu-miR-26a-5p, mmu-let-7c-5p, mmu-let-7b-5p sono risultati up-regulati nel siero dei topi Col6a1-/- mentre mmu-miR-29b-3p e mmu-miR-29a-3p down-regulati.
Questi miRNAs potrebbero
giocare un ruolo importante nella patogenesi delle collagenopatie in quanto legano geni coinvolti in importanti pathway molecolari necessarie ad un corretto sviluppo e differenziamento della cellula muscolare, e a pathway coinvoltie nella produzione di proteine della ECM.
I pathway interessati sono stati: ERBb, MAPK, PIK3/Akt, mTOR, ECM-receptors, actin cytoskeleton, focal adhesion e calcium signalling.
In conclusione in questo studio sono stati identificati e selezionati 6 miRNA significativamente disregolati miRNA significativamente disregolati (mmu-miR-195a-5p, mmu-miR-26a-5p, mmu-let-7c-5p, mmu-let-7b-5p, mmu-miR-29b-3p and mmu-miR-29a-3p) nel modello murino di topo knock down per il collagene VI.
Questi miRNA sono candidati alla caratterizzazione nel siero di pazienti con UCM e BM e potrebbero diventare ottimi biomarcatori non invasivi per la diagnosi ed il follow-up dei pazienti.
Ulteriori studi verranno effettuati in ampie coorti di pazienti affetti al per confermare questi dati preliminari.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Pegoraro, Elena
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 27 > scuole 27 > SCIENZE MEDICHE, CLINICHE E SPERIMENTALI > NEUROSCIENZE
Data di deposito della tesi:27 Gennaio 2015
Anno di Pubblicazione:2015
Parole chiave (italiano / inglese):miRNA
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/26 Neurologia
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Neuroscienze
Codice ID:7622
Depositato il:13 Nov 2015 09:07
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Bibliografia

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