Influenza A viruses, capable of infecting humans and birds, are associated not only to seasonal epidemics, but also to pandemics, with an high impact on Public Health. The emergence of influenza viruses to the currently available drugs and the lack of universal vaccination strategies are main human and veterinarian concerns. Thus, the research of innovative targets for the development of therapeutic anti-influenza A virus strategies is still required. The aim of this study was to develop an innovative antiviral approach based on the delivery into eukaryotic cells susceptible to influenza virus infection of small RNA molecules targeting the highly conserved regions mapping at the 5’ ends of the 3 viral genomic segments encoding for the polymerase (PA, PB1, PB2), an enzyme essential for viral replication (Giannecchini S. et al., 2009- 2011). The target sequences represent the packaging signals of these 3 genomic segments and play an important role during the assembly and budding of the newly formed particles (Qinshan Gao et al., 2012). To this end, we developed different lentiviral vectors expressing miRNAs [pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR] or antisense-RNAs [pLentilox 3.7 GFP] targeting PA, PB1 and PB2 segments. Recombinant lentiviral particles, produced by transfecting human embryonic kidney cells (293T) with both vectors in combination with a packaging systems, were harvested and titrated on human alveolar adenocarcinoma cell line (A549) by FACS analysis. The lentiviral vectors transduction efficiency on different cell lines was evaluated by FACS assay and by quantitative Real-Time PCR. The transduced cells were infected with epidemiologically relevant human influenza viruses type A and B and avian viruses type A. The viral inhibitory activity was assessed by employing an infectivity assay. We showed that recombinant lentiviral particles expressing miRNA or antisense-RNAs efficiently transduced A549 cell lines that are highly susceptible to influenza virus replication. More importantly, a reduction from 1 to 3 logatims of the viral titre was obtained in all tested cell lines infected with human and avian subtypes of influenza type A viruses. By contrast, no inhibition of influenza type B virus was observed. Furthermore, mutations within the target sequences abolished the antiviral effects of the developed vectors, thus confirming the specificity of the approach. Our study contributes to the demonstration that the expression of small RNAs targeting the packaging signal of the polymerases gene might represent an efficient strategy against the influenza A virus infection in human (especially in pandemic events) and birds.

I virus dell'influenza di tipo A sono in grado di infettare gli esseri umani e gli uccelli ed essendo responsabili non solo di di epidemie stagionali, ma anche di pandemie, hanno un impatto importante per la Salute Pubblica. L' insorgenza di virus influenzali resistenti ai farmaci attualmente disponibili e la mancanza di una terapia vaccinale universale sono una fonte di costante preoccupazione tanto per la popolazione umana quanto per quella animale. Pertanto, la ricerca di nuovi bersagli per lo sviluppo di approcci terapeutici / preventivi nei confronti del virus influenzale di tipo A è ancora necessaria. Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare e valutare una strategia antivirale innovativa basata sul delivery in cellule eucariotiche suscettibili d’infezione da parte del virus dell’influenza di tipo A di piccoli RNA. Questi ultimi hanno come bersaglio le regioni conservate presenti al 5’ dei 3 segmenti del genoma virale codificanti la polimerasi (PA, PB1, PB2), enzima essenziale perché il virus possa replicarsi (Giannecchini S. et al., 2009- 2011). Nelle regioni bersaglio si trovano i segnali di packaging, che svolgono un ruolo importante durante le fasi di assemblaggio e gemmazione delle particelle virali nascenti (Qinshan Gao et al., 2012). A tale scopo, abbiamo sviluppato diversi vettori lentivirali esprimenti miRNA [pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR] o antisenso-RNA [pLentilox 3.7 GFP] diretti verso i segmenti genomici PA, PB1 e PB2. Le particelle lentivirali ricombinanti, sono state prodotte trasfettando cellule umane embrionali renali (293T) con entrambi i vettori insieme ad un appropriato sistema di packaging. Leparticelle lentivirali ricombinanti sono state utilizzate per trasdurre le cellule umane di derivazione alveolare (A549) che rappresentano un ottimo modello per lo studio di molecole in grado di interferire con la replicazione del virus dell’influenza di tipo A. Le cellule trasdotte sono state quindi infettate con virus dell'influenza di tipo A di origine umana e aviaria e con un virus di tipo B. L’effetto di inibizione sul titolo della progenie virale è stato valutato mediante un test di infettività. Abbiamo dimostrato che le particelle lentivirali ricombinanti che esprimono miRNA o antisenso-RNA, trasducendo in modo efficiente la linea cellulare A549, determinano una riduzione del titolo virale che varia dagli 1 a 3 logaritmi, a seconda del virus e del bersaglio molecolare preso in esame. Al contrario, non è stata osservato nessun effetto nel caso del virus dell'influenza di tipo B. Inoltre, mutazioni all'interno delle sequenze bersaglio fanno sì che non vi siano più effetti antivirali dei vettori sviluppati, confermando la specificità dell’approccio sviluppato. I nostri dati contribuiscono alla dimostrazione che il delivery intracellualre di piccoli RNA specifici per i segnali di packaging dei geni virali codificanti la polimerasi, possono rappresentare una valida strategia terapeutica nei confronti dei virus dell’influenza umani, specialmente nell’eventualità di insorgenza di virus pandemici, e aviari.

Sviluppo di un approccio terapeutico basato su piccoli rna diretti verso i segmenti genomici codificanti la polimerasi del virus dell'influenza / Martelli, Francesco. - (2015 Jan 28).

Sviluppo di un approccio terapeutico basato su piccoli rna diretti verso i segmenti genomici codificanti la polimerasi del virus dell'influenza

Martelli, Francesco
2015

Abstract

I virus dell'influenza di tipo A sono in grado di infettare gli esseri umani e gli uccelli ed essendo responsabili non solo di di epidemie stagionali, ma anche di pandemie, hanno un impatto importante per la Salute Pubblica. L' insorgenza di virus influenzali resistenti ai farmaci attualmente disponibili e la mancanza di una terapia vaccinale universale sono una fonte di costante preoccupazione tanto per la popolazione umana quanto per quella animale. Pertanto, la ricerca di nuovi bersagli per lo sviluppo di approcci terapeutici / preventivi nei confronti del virus influenzale di tipo A è ancora necessaria. Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare e valutare una strategia antivirale innovativa basata sul delivery in cellule eucariotiche suscettibili d’infezione da parte del virus dell’influenza di tipo A di piccoli RNA. Questi ultimi hanno come bersaglio le regioni conservate presenti al 5’ dei 3 segmenti del genoma virale codificanti la polimerasi (PA, PB1, PB2), enzima essenziale perché il virus possa replicarsi (Giannecchini S. et al., 2009- 2011). Nelle regioni bersaglio si trovano i segnali di packaging, che svolgono un ruolo importante durante le fasi di assemblaggio e gemmazione delle particelle virali nascenti (Qinshan Gao et al., 2012). A tale scopo, abbiamo sviluppato diversi vettori lentivirali esprimenti miRNA [pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR] o antisenso-RNA [pLentilox 3.7 GFP] diretti verso i segmenti genomici PA, PB1 e PB2. Le particelle lentivirali ricombinanti, sono state prodotte trasfettando cellule umane embrionali renali (293T) con entrambi i vettori insieme ad un appropriato sistema di packaging. Leparticelle lentivirali ricombinanti sono state utilizzate per trasdurre le cellule umane di derivazione alveolare (A549) che rappresentano un ottimo modello per lo studio di molecole in grado di interferire con la replicazione del virus dell’influenza di tipo A. Le cellule trasdotte sono state quindi infettate con virus dell'influenza di tipo A di origine umana e aviaria e con un virus di tipo B. L’effetto di inibizione sul titolo della progenie virale è stato valutato mediante un test di infettività. Abbiamo dimostrato che le particelle lentivirali ricombinanti che esprimono miRNA o antisenso-RNA, trasducendo in modo efficiente la linea cellulare A549, determinano una riduzione del titolo virale che varia dagli 1 a 3 logaritmi, a seconda del virus e del bersaglio molecolare preso in esame. Al contrario, non è stata osservato nessun effetto nel caso del virus dell'influenza di tipo B. Inoltre, mutazioni all'interno delle sequenze bersaglio fanno sì che non vi siano più effetti antivirali dei vettori sviluppati, confermando la specificità dell’approccio sviluppato. I nostri dati contribuiscono alla dimostrazione che il delivery intracellualre di piccoli RNA specifici per i segnali di packaging dei geni virali codificanti la polimerasi, possono rappresentare una valida strategia terapeutica nei confronti dei virus dell’influenza umani, specialmente nell’eventualità di insorgenza di virus pandemici, e aviari.
28-gen-2015
Influenza A viruses, capable of infecting humans and birds, are associated not only to seasonal epidemics, but also to pandemics, with an high impact on Public Health. The emergence of influenza viruses to the currently available drugs and the lack of universal vaccination strategies are main human and veterinarian concerns. Thus, the research of innovative targets for the development of therapeutic anti-influenza A virus strategies is still required. The aim of this study was to develop an innovative antiviral approach based on the delivery into eukaryotic cells susceptible to influenza virus infection of small RNA molecules targeting the highly conserved regions mapping at the 5’ ends of the 3 viral genomic segments encoding for the polymerase (PA, PB1, PB2), an enzyme essential for viral replication (Giannecchini S. et al., 2009- 2011). The target sequences represent the packaging signals of these 3 genomic segments and play an important role during the assembly and budding of the newly formed particles (Qinshan Gao et al., 2012). To this end, we developed different lentiviral vectors expressing miRNAs [pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR] or antisense-RNAs [pLentilox 3.7 GFP] targeting PA, PB1 and PB2 segments. Recombinant lentiviral particles, produced by transfecting human embryonic kidney cells (293T) with both vectors in combination with a packaging systems, were harvested and titrated on human alveolar adenocarcinoma cell line (A549) by FACS analysis. The lentiviral vectors transduction efficiency on different cell lines was evaluated by FACS assay and by quantitative Real-Time PCR. The transduced cells were infected with epidemiologically relevant human influenza viruses type A and B and avian viruses type A. The viral inhibitory activity was assessed by employing an infectivity assay. We showed that recombinant lentiviral particles expressing miRNA or antisense-RNAs efficiently transduced A549 cell lines that are highly susceptible to influenza virus replication. More importantly, a reduction from 1 to 3 logatims of the viral titre was obtained in all tested cell lines infected with human and avian subtypes of influenza type A viruses. By contrast, no inhibition of influenza type B virus was observed. Furthermore, mutations within the target sequences abolished the antiviral effects of the developed vectors, thus confirming the specificity of the approach. Our study contributes to the demonstration that the expression of small RNAs targeting the packaging signal of the polymerases gene might represent an efficient strategy against the influenza A virus infection in human (especially in pandemic events) and birds.
Influenza virus, sequenze di packaging, vettori lentivirali.
Sviluppo di un approccio terapeutico basato su piccoli rna diretti verso i segmenti genomici codificanti la polimerasi del virus dell'influenza / Martelli, Francesco. - (2015 Jan 28).
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