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Grigoletto, Antonella (2015) Studies on polymer conjugation of therapeutic proteins and peptides. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Since the introduction of recombinant insulin in 1979 and thanks to the advances in pharmaceutical biotechnology, therapeutic proteins and peptides have gained significant importance in the treatment of many diseases and after they represent the only therapeutic option. However, such growing success is not devoid of potential pitfalls like short half-life, easy enzymatic degradation and immunogenicity. PEGylation, namely the attachment of polyethylene glycol (PEG) chain(s) to a bioactive molecule, is nowadays one of the most commonly used strategies to overcome the inherent limits of therapeutic proteins.
The studies reported in this thesis are focused on the design and preparation of conjugates of therapeutic proteins and peptides with optimized polymeric carriers, in order to obtain improved performances in both pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles of a conjugated biologic. The proteins and the peptide used are recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), recombinant human growth hormone (hGH) and KR14, an anti-HIV triazole peptide (PT). G-CSF, hGH and KR14, owing to their low molecular weights, are rapidly excreted from the body and are subject to proteolytic degradation, resulting in low bioavailability and therefore requiring frequent administration schedule.
The first part of this PhD thesis was focused on: i) transglutaminase-mediated conjugation of common non charged or new multicarboxylic PEGs to G-CSF, ii) characterization and stability studies of the conjugates, iii) pharmacokinetic studies in animals, to allow the comparison between the conjugates and with the reference G-CSF. In this study, the aim was to test multicarboxylic PEG derivatives for evaluating the contribution of negative charges on protein half-life prolongation thanks to the charge-selective property of the glomerular filtration barrier. PEGylation with high molecular weight PEGs, by increasing the hydrodynamic volume of a protein, decreases the glomerular filtration rate, but may constitute a steric hindrance and reduce the binding affinity between the therapeutic protein and its target. The charge selectivity concept of the glomerular filtration barrier can be exploited with the new polyanionic polymers, which with low molecular weights, can still extend the PK profile of the protein and achieve also a better preservation of protein activity.
The investigated polyanionic PEG derivatives were i) H2N-PEG5k-(COOH)7, a heterobifunctional PEG that was derivatized on one end with β-glutamic acid units to contain 7 carboxyl groups and ii) H2N-PEG3.4k-b-PLE50, a linear polyanionic polymer that consists of a PEG linked to a PLE with the pendant ϒ-carboxyl groups of glutamic acid monomers. In addition to these two multicarboxylic PEGs, two classic uncharged PEGs with molecular weights of 5 kDa and 20 kDa were also used. After PEGylation, all the G-CSF-PEG conjugates were characterized by MALDI-TOF mass spectrometry, SDS-PAGE and circular dichroism and the pharmacokinetic studies were carried out in rats.
The second part of this PhD thesis focused on the comparison of the biological activity (stimulation of somatic growth) of three hGH conjugates differing for the polymeric carrier (multicarboxylic or neutral) and for the site of polymer conjugation. The aim of this study was to evaluate if the protein stability and the protein/receptor recognition were influenced by the site of conjugation of the polymer and to assess the impact of polyanionic carriers on the pharmacodynamic behaviour of the protein.
Conjugation of the multicarboxylic polymer, poly(L-glutamic acid), resulted in an increase of the final negative charge of the conjugate. Based on the charge selectivity concept of glomerular filtration, polyanionic polymers having relatively low molecular weights may provide a half-life extension of a given protein, similar to that provided by higher molecular weight neutral polymers. Two different site-specific mono-PEGylated forms of hGH were prepared exploiting an enzymatic PEGylation (PEG-Gln141-hGH) via transglutaminase (TGase) and a chemical N-terminal PEGylation (PEG-Nter-hGH), using neutral 20kDa PEGs. Interestingly the conjugates showed an increased thermal stability and the ability to refold after thermal denaturation.
The third monoconjugate of hGH was prepared by chemical N-terminal conjugation, using poly(L-glutamic acid) with 50 glutamic acid units and with an aldehyde function at one end (PLE50ald). The glutamic acid monomers confer to this polymer a polyanionic characteristic. hGH-PLE50ald was characterized by MALDI-TOF mass spectrometry, SDS-PAGE, circular dichroism and the pharmacokinetic studies were carried out in rats. The bioactivities of a single dose of hGH-PLE50ald, PEG-Gln141-hGH and PEG-Nter-hGH were similar or even better to that of a daily injection of hGH, by testing the somatic growth in hypophysectomized rats.
The third section of this work has dealt with: synthesis and characterization of KR14 peptide and its conjugation with PEG20kDa-Mal, pharmacokinetic studies of the conjugate in mice and SPR affinity binding experiments. A part of this work was developed at the Department of Biochemistry and Molecular Biology of the Drexel University College of Medicine in Philadelphia, under the supervision of Professor Irwin Chaiken, whose laboratory is focused on the design and realization of peptide drugs that inhibit the entry of HIV-1 in the target cells. This initial step of HIV-1 entry is characterized by the binding of envelope glycoprotein gp120 on to the cellular receptor CD4 and co-receptor. The triazole peptide KR14 derive from a previously known family of PT’s that has great therapeutic potential as it exhibits high affinity binding to gp120 and inhibits interactions of gp120 with both CD4 and the co-receptor surrogate mAb17b. KR14 was designed to contain a free thiol group at position 16 that has been exploited to achieve selective PEGylation with a PEG-maleimide of 20 kDa. The identity and purity of the conjugate were confirmed by SEC-HPLC and MALDI-TOF. Pharmacokinetic studies in mice demonstrated that PEGylation extended the t1/2 of the peptide from 44 min to 289 min. Even more remarkably the conjugate did not show the typical loss in bioactivity, common to most PEGylated drugs. In fact SPR studies demonstrated that PEG-KR14 is only about 1.5, 1.6 fold less active than KR14, a relevant result. In conclusion the studies of this PhD thesis further demonstrated the potential of PEGylation in the delivery of protein and peptides. Although PEGylation is already a mature technology that yielded several products in clinical use, we demonstrated that there are still reasons for implementation and new discoveries by pursing also the renal filtration charge selectivity and not only the size selectivity as done so far in this field.

Abstract (italiano)

Sin dall’introduzione dell’insulina ricombinante, nel 1979 e grazie ai progressi della biotecnologia farmaceutica, proteine e peptidi terapeutici hanno raggiunto una significativa importanza nel trattamento di molte patologie e rappresentano l’unica opzione terapeutica. Questo crescente successo non è comunque, privo di potenziali ostacoli come una breve emivita, una facile degradazione enzimatica e l’immunogenicità. La PEGhilazione, ovvero il legame di catene di polietilenglicole (PEG) a molecole bioattive, è oggigiorno una delle più comuni strategie usate per superare i limiti inerenti alle proteine terapeutiche.
Gli studi riportati in questa tesi di dottorato sono focalizzati sulla progettazione e preparazione di coniugati di proteine e peptidi terapeutici con carrier polimerici ottimizzati, in modo da ottenere migliori prestazioni dell’entità coniugata, sia dal punto di vista del profilo farmacocinetico che farmacodinamco. Le proteine e il peptide usati in questo lavoro sono G-CSF, o fattore di crescita umano ricombinante stimolante la formazione di colonie granulocitiche, hGH, o ormone della crescita umano ricombinante e KR14, un peptide anti-HIV. G-CSF, hGH e KR14, a causa del loro basso peso molecolare, sono rapidamente eliminati dall’organismo e sono soggetti a degradazione proteolitica, con conseguente bassa biodisponibilità e necessità di somministrazioni frequenti.
La prima parte di questa tesi di dottorato è focalizzata su: i) PEGhilazione enzimatica via transglutaminasi di G-CSF a PEG non carichi e a nuovi PEG multicarbossilati, ii) caratterizzazione e studi di stabilità dei coniugati ottenuti, iii) studi farmacocinetici in ratti, per avere un confronto tra i coniugati e la proteina nativa come riferimento. Lo scopo di questo studio è stato quello di testare i PEG multicarbossilati per valutare il contributo delle cariche negative sul prolungamento dell’emivita della proteina, grazie alle proprietà di selezione della carica della barriera di filtrazione del glomerulo. La PEGhilazione con PEG ad alto peso molecolare, aumentando il volume idrodinamico della proteina, riduce la velocità di filtrazione glomerulare, ma può costituire un impedimento sterico e ridurre l’affinità di legame tra la proteina terapeutica e il suo target. Il concetto di selettività della carica della barriera di filtrazione glomerulare può essere sfruttato con i nuovi polimeri polianionici, che, con un basso peso molecolare, possono mantenere un profilo farmacocinetico della proteina esteso e raggiungere anche una migliore conservazione dell’attività della proteina. I PEG polianionici usati per questo lavoro sono stati i) H2N-PEG5k-(COOH)7, un PEG eterobifunzionale che è stato derivatizzato ad un’estremità con unità di acido β-glutammico e che possiede 7 gruppi carbossilici e ii) H2N-PEG3.4k-b-PLE50, un polimero polianionico lineare costituito da PEG legato a PLE, il quale possiede i gruppi pendenti ϒ-carbossilici dei monomeri dell’acido glutammico. Oltre a questi due PEG multicarbossilati, sono stati usati anche due PEG non carichi, di peso molecolare 5 e 20 kDa. Dopo PEGhilazione, tutti i coniugati di G-CSF sono stati caratterizzati tramite MALDI-TOF, SDS-PAGE e dicroismo circolare e gli studi farmacocinetici sono stati condotti in ratti.
La seconda parte di questa tesi di dottorato si focalizza sul confronto dell’attività biologica (stimolazione della crescita somatica) di tre coniugati dell’ormone della crescita che si differenziano per il carrier polimerico (multicarbossilato o neutro) e per il sito di coniugazione del polimero. Lo scopo di questo studio è stato valutare se la stabilità della proteina e il riconoscimento proteina/recettore sono stati influenzati dal sito di coniugazione del polimero e verificare l’impatto di carrier polianionici sul profilo farmacodinamico della proteina. La coniugazione del polimero multicarbossilato, acido (poli)glutammico, risulta in un aumento della carica negativa netta del coniugato. Sulla base del concetto di selettività della carica della filtrazione glomerulare, polimeri polianionici aventi pesi molecolari relativamente bassi, possono fornire un’estensione dell’emivita di una proteina simile a quella ottenuta con polimeri neutri di alto peso molecolare. Due diverse forme di hGH mono-PEGhilato in maniera sito-specifica sono state preparate sfruttando una PEGhilazione enzimatica (PEG-Gln141-hGH) via tranglutaminase (TGase) e una PEGhilazione chimica all’N-terminale (PEG-Nter-hGH), usando PEG neutri di peso molecolare 20 kDa. Interessante è il fatto che i coniugati hanno mostrato una stabilità termica aumentata e la capacità di refold dopo denaturazione termica.
Il terzo monoconiugato di hGH è stato preparato tramite coniugazione all’N-terminale, usando un acido (poli)glutammico con 50 unità di acido glutammico e con una funzione aldeidica ad un’estremità (PLE50ald). I monomeri di acido glutammico conferiscono al polimero la caratteristica di polianionico. hGH-PLE50ald è stato caratterizzato tramite MALDI-TOF, SDS-PAGE, dicroismo circolare e gli studi farmacocinetici sono stati condotti in ratti. La bioattività di una dose singola di hGH-PLE50ald, PEG-Gln141-hGH e PEG-Nter-hGH si è dimostrata simile o migliore rispetto a iniezioni giornaliere di hGH, misurando la crescita somatica in ratti ipofisectomizzati.
La terza parte di questo lavoro tratta di: sintesi e caratterizzazione di KR14 e coniugazione di KR14 a PEG20kDa-Mal, studi farmacocinetici del coniugato in topi e studi di affinità di legame tramite SPR. Una parte di questo lavoro è stata sviluppata al Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare presso Drexel University College of Medicine a Philadelphia, sotto la supervisione del Professor Irwin Chaiken, il cui laboratorio è focalizzato sulla progettazione e realizzazione di farmaci peptidici che inibiscono l’entrata del virus HIV-1 nelle cellule target. Questo passaggio iniziale di entrata del virus è caratterizzato dal legame della glicoproteina di membrana gp120 al recettore cellulare CD4 e al co-recettore. Il peptide KR14 proviene da una famiglia già nota di peptidi, modificati con triazolo, che ha un considerevole potenziale terapeutico, esibendo alta affinità di legame per la gp120 e inibendo le interazioni di gp120 con CD4 e con il surrogato del co-recettore mAb17b.
KR14 è stato progettato in modo da comprendere un gruppo tiolico libero in posizione 16, che è stato utilizzato per la PEGhilazione selettiva con un PEG-maleimide di 20 kDa. L’identità e la purezza del coniugato sono state confermate tramite SEC-HPLC e MALDI-TOF. Gli studi farmacocinetici in topi hanno dimostrato che la PEGhilazione ha prolungato l’emivita del peptide da 44 minuti a 289 minuti. Ancora più interessante, il coniugato non ha mostrato la tipica perdita di bioattività, comune alla maggior parte dei farmaci PEGhilati. Infatti gli studi SPR hanno dimostrato che PEG-KR14 è solo 1,5, 1,6 volte meno attivo di KR14, un risultato rilevante.
In conclusione gli studi di questa tesi di dottorato hanno dimostrato ulteriormente il potenziale della PEGhilazione nella veicolazione di proteine e peptidi. Anche se la PEGhilazione è già una tecnologia matura che ha portato diversi prodotti in uso clinico, abbiamo dimostrato che ci sono ancora motivi per l’implementazione e le nuove scoperte, perseguendo anche la selettività di carica della filtrazione renale e non solo la selettività per dimensioni, come fatto finora in questo campo.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Pasut, Gianfranco
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 27 > scuole 27 > SCIENZE MOLECOLARI > SCIENZE FARMACEUTICHE
Data di deposito della tesi:29 Gennaio 2015
Anno di Pubblicazione:29 Gennaio 2015
Parole chiave (italiano / inglese):Coniugazione/Conjugation, Coniugazione polimerica/Polymer conjugation, (Poli)etilenglicole/(Poly)ethylene glycole, Veicolazione di proteine/Protein delivery, Proteine terapeutiche/Therapeutic proteins
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 03 - Scienze chimiche > CHIM/09 Farmaceutico tecnologico applicativo
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze del Farmaco
Codice ID:7738
Depositato il:12 Nov 2015 15:38
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Bibliografia

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[1] B. Leader, Q.J. Baca, D.E. Golan, Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification, Nat. Rev. Drug Discovery 7 (2008) 21–39. Cerca con Google

[2] D. Platis, N.E. Labrou, Chemical and genetic engineering strategies to improve the potency of pharmaceutical proteins and enzymes, Curr. Med. Chem. 15 (2008) 1940–1955. Cerca con Google

[3] L. Jorgensen, H.M. Nielson, Delivery Technologies for Biopharmaceuticals: Peptides, Proteins, Nucleic Acids and Vaccines, JohnWiley & Sons, Ltd.,West Sussex (U.K, 2009. Cerca con Google

[4] Veronese FM and Pasut G, PEGylation: Posttranslational bioengineering of protein biotherapeutics, Drug Discovery Today: Technologies 5 (2-3) (2008), 57-64. Cerca con Google

[5] C. Dhalluin, A. Ross, L.A. Leuthold, S. Foser, B. Gsell, F. Müller, H. Senn, Structural and biophysical characterization of the 40 kDa PEG-interferon-alpha2a and its individual positional isomers, Bioconjug. Chem. 16 (3) (2005) 504–517. Cerca con Google

[6] A. Basu, K. Yang, M. Wang, S. Liu, R. Chintala, T. Palm, H. Zhao, P. Peng, D. Wu, Z. Zhang, J. Hua, M.C. Hsieh, J. Zhou, G. Petti, X. Li, A. Janjua, M. Mendez, J. Liu, C. Longley, Z. Zhang, M. Mehlig, V. Borowski, M. Viswanathan, D. Filpula, Structure-function engineering of interferon-beta-1b for improving stability, solubility, potency, immunogenicity, and pharmacokinetic properties by site-selective mono-PEGylation, Bioconjug. Chem. 17 (2006) 618–630. Cerca con Google

[7] F. Meng, B.N. Manjula, P.K. Smith, S.A. Acharya, PEGylation of human serum albumin: reaction of PEG-phenyl-isothiocyanate with protein, Bioconjug. Chem. 19 (2008) 1352–1360. Cerca con Google

[8] F.M. Veronese, A. Mero, F. Caboi, M. Sergi, C. Marongiu, G. Pasut, Site-specific pegylation of G-CSF by reversible denaturation, Bioconjug. Chem. 18 (2007)1824–1830. Cerca con Google

[9] Giorgi ME, Agusti R, and Lederkremer RM, Carbohydrate PEGylation, an approach to improve pharmacological potency, Beilstein J. Org. Chem. 10 (2014), 1433–1444. Cerca con Google

[10] L. Mariniello, R. Porta, Transglutaminases as biotechnological tools, in: K. Mehta, R. Eckert (Eds.), Transgluatminase, Prog. Exp. Tum. Res., vol. 38, Karger, Basel, 2005, pp. 174–191. Cerca con Google

[11] D. Aeschlimann, M. Paulsson, Transglutaminases: protein cross-linking enzymes in tissues and body fluids, Thromb. Haemost. 71 (1994) 402–415. Cerca con Google

[12] R. Griffin, R. Casadio, C.M. Bergamini, Transglutaminases: natures biological glues, Biochem. J. 368 (2002) 377–396. Cerca con Google

[13] Rachel NM and Pelletier JN, Biotechnological Applications of Transglutaminases, Biomolecules 3 (2013), 870-888. Cerca con Google

[14] T. Kashiwagi, K. Yokoyama, K. Ishikawa, K. Ono, D. Ejima, H. Matui, E. Suzuki, Crystal structure of microbial transglutaminase from Streptoverticillium mobaraense, J. Biol. Chem. 277 (2002) 44252–44260. Cerca con Google

[15] K. Yokoyama, N. Nio, Y. Kikuchi, Properties and applications of microbial Cerca con Google

transglutaminase, Appl. Microbiol. Biotechnol. 64 (2004) 447–454. Cerca con Google

[16] H. Sato, Enzymatic procedure for site-specific PEGylation of proteins, Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 487–504. Cerca con Google

[17] Mero A, Spolaore B, Veronese FM, and Fontana A, Transglutaminase-Mediated PEGylation of Proteins: Direct Identification of the Sites of Protein Modification by Mass Spectrometry using a Novel Monodisperse PEG, Bioconjugate Chem 20 (2009), 384–389. Cerca con Google

[18] Coussons PJ, Price NC et al, Factors that govern the specificity of transglutaminase-catalysed modification of proteins and peptides, Biochem J 282 (1992), 929-930. Cerca con Google

[19] Fontana A, Spolaore B, Mero A, and Veronese FM, Site-specific modification and PEGylation of pharmaceutical proteins mediated by transglutaminase, Advanced Drug Delivery Rev 60 (2008), 13–28. Cerca con Google

[20] Mero A, Schiavon M, Veronese FM, and Pasut G, A new method to increase selectivity of transglutaminase mediated PEGylation of salmon calcitonin and human growth hormone, J of Controlled Release 154 (2011), 27–34. Cerca con Google

[21] Maddox DA, Deen WM, Brenner BM, Glomerular filtration. In Handbook of Physiology. Renal Physiology. Bethesda, MD: Am Physiol Soc, sect. 8, vol I, 13, (1992), 545-638. Cerca con Google

[22] Miner JH, Glomerular filtration: the charge debate charges ahead, Kidney International 74 (2008), 259–261. Cerca con Google

[23] Kanwar YS, Danesh FR, and Chugh SS, Contribution of Proteoglycans Towards the Integrated Functions of Renal Glomerular Capillaries, American J of Pathology 171-1 (2007), 139-143. Cerca con Google

[24] Crea F, Giovannetti E, Zinzani PL, and Danesi R, Pharmacologic rationale for early G-CSF prophylaxis in cancer patients and role of pharmacogenetics in treatment optimization, Critical Rev in Oncology/Hematology 72 (2009), 21–44. Cerca con Google

[25] Bendall LJ and Bradstock KF, G-CSF: From granulopoietic stimulant to bone marrow stem cell mobilizing agent, Cytokine & Growth Factor Rev (2014). Cerca con Google

[26] Barreda DR, Hanington PC, and Belosevic M, Regulation of myeloid development and function by colony stimulating factors, Developmental and Comparative Immunology 28 (2004), 509–554. Cerca con Google

[27] Greenbaum AM and Link DC, Mechanisms of G-CSF-mediated hematopoietic stem and progenitor mobilization, Leukemia 25 (2011), 211–217. Cerca con Google

[28] Nervi B, Link DC, and DiPersio JF, Cytokines and Hematopoietic Stem Cell Mobilization, J of Cellular Biochem 99 (2006), 690–705. Cerca con Google

[29] Oh-eda M, Hasegawa M et al, O-linked sugar chain of human granulocyte colony-stimulating factor protects it against polymerization and denaturation allowing it to retain its biological activity, J Biol Chem 265 (1990), 11432-11435. Cerca con Google

[30] Hill CP, Osslund TD, and Eisenberg D, The structure of granulocyte-colony-stimulating factor and its relationship to other growth factors, Proc Natl Acad Sci USA 90 (1993), 5167-5171. Cerca con Google

[31] Zhuge C, Lei J, and Mackey MC, Neutrophil dynamics in response to chemotherapy and G-CSF, J Theoretical Biology 293 (2012), 111–120. Cerca con Google

[32] Vanz ALS, Renard G et al, Human granulocyte colony stimulating factor (hG-CSF): cloning, overexpression, purification and characterization, Microbial Cell Factories (2008) 7:13. Cerca con Google

[33] Scaramuzza S, Tonon G et al, A new site-specific monoPEGylated filgrastim derivative prepared by enzymatic conjugation: Production and physicochemical characterization, J of Controlled Release 164 (2012), 355–363. Cerca con Google

[33] Scaramuzza S, Tonon G et al, A new site-specific monoPEGylated filgrastim derivative prepared by enzymatic conjugation: Production and physicochemical characterization, J of Controlled Release 164 (2012), 355–363. Cerca con Google

[34] Strobl, J. S.; Thomas, M., Growth hormone rapidly activates rat serine protease inhibitor 2.1 gene transcription and induces a DNA-binding activity distinct from those of Stat1,-3, and-4. J. Pharmacol. Rev. 1994, 46, 1. Cerca con Google

[35] Rosen, T.; Bengtsson, Growth hormone therapy in elderly people, B. A. Lancet 1990, 336, 285. Cerca con Google

[36] http://www.hgfound.org/pub_growth.html Vai! Cerca con Google

[37] Chantalat, L.; Jones, N. D.; Korber, F.; Navaza, J.; Pavlovsky, A. G., The crystal-structure of wild-type growth-hormone at 2.5 angstrom resolution, Protein Pept. Lett. 1995, 2, 333. Cerca con Google

[38] De Vos, A. M.; Ultsch, M.; Kossiakoff, A. A., Human growth hormone and extracellular domain of its receptor: crystal structure of the complex, Science 1992, 255, 306. Cerca con Google

[39] Ilondo, M. M.; Damholt, A. B.; Cunningham, B. A.; Wells, J. A.; De Meyts, P.; Shymko, R. M., Receptor dimerization determines the effects of growth hormone in primary rat adipocytes and cultured human IM-9 lymphocytes, Endocrinology 1994, 134, 2397. Cerca con Google

[40] Pearce, K. H., Jr.; Cunningham, B. C.; Fuh, G.; Teeri, T.; Wells, J. A., Growth hormone binding affinity for its receptor surpasses the requirements for cellular activity, Biochemistry, 1999, 38, 81. Cerca con Google

[41] Blethen, S. L.; Baptista, J.; Kuntze, J.; Foley, T.; LaFranchi, S.; Johanson, A., Adult height in growth hormone (GH)-deficient children treated with biosynthetic GH. The Genentech Growth Study Group. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997, 82, 418. Cerca con Google

[42] Hu DJ, Subbarao S, Vanichseni S, et al. Frequency of HIV-1 dual subtype infections, including intersubtype superinfections, among injection drug users in Bangkok, Thailand. AIDS, 19, 303–308, 2005. Cerca con Google

[43] Anna Maria Geretti, HIV-1 subtypes: epidemiology and significance for HIV management. Current Opinion in Infectious Diseases, 19, 1-7, 2006. Cerca con Google

[44] Kwong, P. D., Human immunodeficiency virus: refolding the envelope. Nature, 433, 815–816, 2005. Cerca con Google

[45] Chan, D. C., Fass, D., Berger, J. M., Kim, P. S., Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein. Cell, 89 (2), 263–273, 1997. Cerca con Google

[46] Wyatt, R., Sodroski, J., The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science, 280 (5371), 1884–1888, 1998. Cerca con Google

[47] Gardner MB1, Luciw PA, Sawai ET, Marthas ML, Miller CJ, McChesney MB, Lerche NW, Pedersen NC., Simian retrovirus vaccines: simian retrovirus and simian immunodeficiency lentivirus, AIDS Res Hum Retroviruses. 1996 Mar 20;12(5):399-401. Cerca con Google

[48] Lijun Wu, Norma P. Gerard, Richard Wyatt, Hyeryun Choe, Cristina Parolin, Nancy Ruffing, Alessandra Borsetti, Angelo A. Cardoso, Elizabeth Desjardin, Walter Newman, Craig Gerard, Joseph Sodroski, CD4-induced interaction of primary HIV-1 gp120 glycoproteins with the chemokine receptor CCR-5. Nature, 384, 179-183, 1996. Cerca con Google

[49] Christopher C. Broder* and Ronald G. Collmant, Chemokine receptor and HIV. Journal of Leukocyte Biology, 62, 20-29, 1997. Cerca con Google

[50] Cocchi F., De Vico AL, Garzino-Demo A, Cara A, Gallo RC, Lusso P., The V3 domain of the HIV-1 gp120 envelope glycoprotein is critical for chemokine-mediated blockade of infection. Nat Med, 2, 1244-1247, 1996. Cerca con Google

[51] Willett B J, Hosie M J, Nell JC, Turner JD, Hoxie JA, Common mechanism of infection by lentiviruses. Nature, 385, 587, 1997. Cerca con Google

[52] Umashankara M, McFadden K, Zentner I, Schon A, Rajagopal S, Tuzer F, Kuriakose SA, Contarino M, Lalonde J, Freire E, et al: The active core in a triazole peptide dual-site antagonist of HIV-1 gp120. ChemMedChem 2010, 5(11):1871–1879. Cerca con Google

[53] Gopi H1, Cocklin S, Pirrone V, McFadden K, Tuzer F, Zentner I, Ajith S, Baxter S, Jawanda N, Krebs FC, Chaiken IM., Introducing metallocene into a triazole peptide conjugate reduces its off-rate and enhances its affinity and antiviral potency for HIV-1 gp120, J Mol Recognit. 2009 Mar-Apr;22(2):169-74. doi: 10.1002/jmr.892. Cerca con Google

[54] Snyder, S. L. and Sobocinski, P. Z. (1975) An improved 2,4,6,-trinitrobenzenesulfonic acid method for the determination of amines. Anal. Biochem. 64, 284–288. Cerca con Google

[55] Silva Freitas D1, Mero A, Pasut G., Chemical and enzymatic site specific PEGylation of hGH, Bioconjug Chem. 2013 Mar 20;24(3):456-63. doi: 10.1021/bc300594y. Epub 2013 Mar 4. Cerca con Google

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