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Coassin, Silvia (2015) Development and validation of in vitro diagnostic devices for HPV detection and genotyping. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

The subject of this dissertation is the work I carried out at AB ANALITICA s.r.l. in the context of a doctoral program based on higher apprenticeship, an innovative form of PhD aiming at reducing the distance between academia and business.

In the first part of my PhD I worked on the new version of a product for HPV detection, recently developed at AB ANALITICA: the REALQUALITY RI-HPV STAR device. My task was to bring the original device to a higher level of analytical sensitivity for certain HPV genotypes as required by the World Health Organization (WHO).
This device was based on Real-time PCR and melting curve analysis with intercalating dye technology. The primers used in the original reaction mix were GP5+/GP6+ primers. These primers are capable of detecting most HPV types in aggregate. However, the analytical sensitivity they provide is not equal for all the detected genotypes and their performance was not in compliance with WHO requirements for genotyping tests. Thus, first of all, the primer composition in the reaction mix was modified by adding other primers to the original pair. A multiple primer reaction required employing specific reagents and, at the end, the whole set up of the assay had to be modified. The occasion was used to also improve an ergonomic aspect and amplify the target pathogen and the internal control gene in multiplex instead of running two separate reactions as in the original assay.
Higher analytical sensitivity was achieved, but primer dimers related issues emerged, which could have impaired the correct interpretation of the assay results, and the project was abandoned.

In the second part of my PhD, I worked at the design, development and validation of two new assays for HPV detection, based on Real-time PCR with target specific primers and TaqMan fluorescent probes.
The HPV types detected by the first of the two assays are the 14 most common high risk types, i.e. HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 and 68. The second assay detects the two most common low risk types, i.e. HPV 6, 11, as well as other possible high risk types, i.e. HPV 26, 53, 67, 70, 73 and 82.
Assay 1 has already been validated and its performance resulted largely in compliance with WHO requirements and with the acceptability criteria established in the validation plan. This assay, therefore, is ready to be commercialized under the name REALQUALITY RQ-HPV HR MULTIPLEX.
As for assay 2, some performance parameters have still to be assessed; however, initial data are promising. This second assay, if associated to assay 1, provides the final user with a complete panel for HPV investigation. The two assays combined, therefore, will be soon proposed, as an alternative product, under the name REALQUALITY RQ-HPV HR/LR MULTIPLEX.

Abstract (italiano)

Oggetto di questa tesi è il lavoro svolto presso l’azienda AB ANALITICA s.r.l. nell’ambito di un Dottorato di Ricerca in Alto Apprendistato, una forma innovativa di dottorato che mira ad avvicinare il mondo dell’università a quello del lavoro.

Nella prima parte del mio percorso di dottorato ho lavorato ad un progetto che aveva come obbiettivo lo sviluppo di una nuova versione del prodotto REALQUALITY RI-HPV STAR, un dispositivo per la rilevazione dell’HPV commercializzato da AB ANALITICA. La nuova versione doveva innanzitutto corrispondere ai criteri di sensibilità analitica definiti dalla World Health Organization (WHO) per i dispositivi di genotipizzazione dell’HPV.
La tecnologia su cui si basa il dispositivo originale, e su cui, pertanto, si sarebbe dovuta basare la nuova versione, è la PCR Real-time con intercalante e analisi delle Curve di Melting. I primer utilizzati nella mix del prodotto originale sono i primer GP5+/GP6+. Si tratta di primer consensus che permettono di amplificare la maggior parte dei genotipi (o “tipi”) di HPV in aggregato. La sensibilità analitica di un sistema basato su questi primer non è omogenea rispetto ai diversi tipi di HPV identificabili e, per alcuni di essi, è inferiore a quanto richiesto dal WHO. Per prima cosa, si è stabilito di aggiungere altri primer alla coppia originale. In conseguenza di ciò, si è reso necessario l’impiego di reagenti idonei ad una reazione con molteplici primer ed, alla fine, l’intero assetto del saggio è stato modificato. Con l’occasione si è deciso di modificare un altro aspetto del saggio ed amplificare in multiplex, invece che in due reazioni distinte, il target patogeno ed il controllo interno. Lo scopo di ottenere un più alto livello di sensibilità analitica è stato raggiunto. Tuttavia, nel corso della pre-validazione del nuovo prototipo, sono emerse delle problematiche relative allo sviluppo di dimeri di primer che rischiavano di compromettere la corretta interpretazione dei risultati e che hanno portato alla sospensione del progetto.

Nella seconda parte del mio dottorato ho lavorato alla progettazione, allo sviluppo e alla validazione di altri due dispositivi per la rilevazione dell’HPV, basati, questa volta, su PCR Real-time con primer genotipo-specifici e sonde di tipo TaqMan.
I genotipi di HPV rilevati dal primo dei due saggi sono i 14 genotipi ad alto rischio più diffusi ovvero HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68. Il secondo saggio rileva invece la presenza dei due HPV a basso rischio più diffusi, HPV 6 e 11, e di altri HPV a possibile alto rischio, ovvero HPV 26, 53, 67, 70, 73 e 82.
Il primo saggio è già stato validato e le sue performance rientrano abbondantemente nei parametri stabiliti dal WHO e dal piano di validazione redatto in azienda. Tale saggio risulta, quindi, pronto per essere commercializzato come dispositivo per la detection degli HPV ad alto rischio con il nome REALQUALITY RQ-HPV HR MULTIPLEX.
La validazione del secondo saggio è in corso, ma i primi dati sono promettenti. Il secondo saggio, se associato al primo, permette di offrire un pannello di indagine dell’HPV estremamente completo. Accanto al prodotto corrispondente al primo saggio, ne verrà, pertanto, proposto un secondo, corrispondente ai due saggi associati. Tale prodotto prenderà il nome di REALQUALITY RQ-HPV HR/LR MULTIPLEX.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Lanfranchi, Gerolamo
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 27 > scuole 27 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > GENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE DELLO SVILUPPO
Data di deposito della tesi:01 Febbraio 2015
Anno di Pubblicazione:01 Febbraio 2015
Parole chiave (italiano / inglese):HPV, in vitro diagnostic device, detection, genotyping
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/12 Biochimica clinica e biologia molecolare clinica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:7884
Depositato il:16 Nov 2015 12:35
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