The first part of this thesis aims to develop new tools to explore mitochondrial Ca2+ dynamic in vivo by the improvement of a mitochondria targeting Cameleon probes and by creating a mitochondria targeted Channelrhodopsin. Genetically encoded calcium indicators (GECIs) allow quantitative Ca2+ measurements in different experimental models. Organelle-specific targeting signals are fused with the GECI’s sequence, achieving selective targeting to a specific organelle or cytoplasmic domain. Moreover, GECI’s coding sequences can be placed under the control of tissue specific or inducible promoters, allowing spatial and temporal control of their expression. Different types of GECIs have been created: in our laboratory we use a class of FRET-based Ca2+ sensors, called Cameleons. FRET (Förster resonance energy transfer) microscopy detects the direct transfer of energy from a donor to an acceptor fluorescence protein (FP) in a living cell. Cameleon structure consists of two Ca2+-responsive elements that alter the efficiency of FRET between two FPs: a cyan fluorescent protein (CFP), the donor, and a yellow fluorescent protein (cpV), the acceptor. The two Ca2+-responsive elements are Calmodulin (CaM) and the CaM-binding domain of myosin light chain kinase. As reported in the beginning, the aim of this study is to develop novel molecular sensors and new methodologies to express the probes in vivo in intact tissues as well as in organisms in order to explore organelle Ca2+ dynamics in vivo (in particularly in brain and heart). One of the limitations of Cameleon probes, especially critical for in vivo applications, is the low fluorescence of CFP, reducing the maximal obtainable signal-to-noise ratio, and a multi-exponential lifetime, indicating the presence of multiple excited-state decay pathways. Recently, a brighter and more stable FP, compared to CFP, has been developed: mCerulean3. It has high fluorescence quantum yield and high photostability, making this protein a good donor candidate in Cameleon probes. For this reason, CFP has been replaced with mCerulean3 in two different Cameleons: the cytosolic D3cpv and the mitochondria-targeted probe named 4mtD3cpv. The new probes have been tested in different cell types: HeLa, neonatal rat cardiomyocytes and neonatal mouse neurons. The brightness, the photostability, the pH-sensitivity and the dissociation constant (Kd) of the new probes have also been measured in situ and the data show a clear improvement in brightness and in photostability, compared to the original Cameleons, in both cytosolic and mitochondrial probes. The only drawback of the new probes is a reduced amplitude (about 20-30%) in the maximum change in the fluorescence emission ratio due to Ca2+ binding (dynamic range). In order to extend the dynamic range different approaches have been used. The addition of 16 glycines between the two Ca2+ responsive elements allowed us to generate a new cytosolic probe (D3mCerulean3+16) with an increased dynamic range (+ 20%). Similarly, we have modified the mitochondrial probe, starting from the targeting sequence, each N-terminal sequence of COX-VIII (subunit VIII of human cytochrome C oxidase) was elongated of 5 aminoacids. Indeed, 24 h after transfection a significant mis-localization in the cytosol was observed with the original probe, while the mis-targeting of the modified targeting sequence containing probe was decreased. Moreover, the reduction in the dynamic range due to the mCerulean3 presence was almost fully recovered adding the 16 glycines linker. We than analysed the effect of pH, observing a general stability of all the probe variants in the pH range tested. Finally, we evaluated the Ca2+ affinity of all the mitochondrial variants generated so far, obtaining a Kd of 0.06 µM and one of 10.84 µM in 4mtD3cpV, a Kd of 6,5 µM in 4mtD3mCerulean3 and a Kd of 0.03 µM and one of 10.7 µM in 4mtD3mCerulean3+16. To better characterize the new cytosolic and mitochondrial Cameleon probes, we purified the proteins expressed in E.Coli in order to measure also in vitro all the parameters described above. Up to now only preliminary data have been obtained, however a comparison of in situ and in vitro data suggests that the DR calculated for cytosolic probes is about 3, while that for a mitochondria like environment is about 2.5. Concerning the Ca2+ affinity, just few [Ca2+] concentrations have been tested so far, therefore all the mitochondrial and cytosolic probes display a single Kd. However, further experiments are required to confirm the in vitro calculated Kd. In parallel, we are also assessing another method to measure Ca2+ with FRET-GECIs, as an alternative of the classical intensity-based method. We are indeed employing FLIM technique that measures the lifetime of FPs (the time the molecule spend in the exited state), which is totally independent from phenomena such as probe photobleaching, expression level, image shading. Preliminary results in cells expressing all the Camelon probes described so far, suggest the presence of homo-FRET phenomena and mCerulean3-based Ca2+ sensors seem to be less affected by them. Finally, to express the new probes in vivo we are testing three strategies: i) adeno-associated virus (serotype 9) with cardiac tropism viral vectors; ii) adeno-associated virus (serotype 9) with neuron-specific promoters (synapsin promoter) for intracranial injection; iii) transgenic mice. These strategies will allow us to perform in vivo Ca2+ measurements in different tissues and subcellular compartments. We have just generated the AAV9 for the expression of the D3mCerulean3 and 4mD3mCerulean3 under the control of CMV promoter. A good expression levels in heart was obtained through intraperiotneal injection of neonatal mice. In conclusion, the results obtained so far make the mCerulean3-based Cameleons an attractive choice for in vivo experiments. To study the role of mitochondria in situ and in vivo, we also took advantage of an optogenetic tool: Channel Rhodopsins (ChRs). ChRs represent the only type of ion channels directly gated by light. When excited by light, ChRs open and depolarize the plasma membrane. For activation, opsins require binding of retinal, a vitamin A–related organic cofactor. In collaboration with Prof. Sekler’s group (Ben-Gurion University-Israel), we have developed a new mitochondria-targeted ChR, called mitochondrial Stabilized Step Function Opsin (4mt-SSFO). This ChR variant was modified to stabilize the conducting state of the channel: SSFO deactivation occurs in 30 minutes after a brief pulse of activating blue light (460-480 nm). It has also been reported the possibility to terminate the photocurrents with red light. To create a non-functional control, a truncated form Chr2(TR) lacking retinal binding site was generated. The targeting of proteins to the inner mitochondrial membrane (IMM) was obtained fusing four signal sequences, derived from human cytochrome C oxidase subunit VIII sequence, to the N-terminus of ChR. To verify the correct topology of the probe, confocal microscopy, elecrtophisiological recordings and fluorescence quenching experiments were carried out. When 4mtSSFO-YFP is properly inserted in the IMM, its C-terminal YFP tag should face the mitochondrial matrix. Indeed, the application of proteinase K to Digitonin permeabilized cells did not cause a significant reduction of 4mtChR2B-YFP signal, while that of N33D3cpv (a probe in which the YFP is located on the cytoplasmic surface of the OMM) is completely abolished. Trypan blue addition, that is permeable across the OMM, but not the IMM, did not affect the fluorescence of 4mtSSFO-YFP or that of the matrix located Cameleon 4mtD3cpv. The 4mtD3cpv fluorescence however was totally lost after alamethicin application that permeabilizes both mitochondrial membranes and releases all matrix proteins into the medium, while the fluorescence of 4mtSSFO-YFP was not affected by the latter treatment, as expected for a membrane bound protein. Taken together these data are consistent with a proper IMM localization. The new mitochondrial 4mtSSFO-YFP constructs were then tested in situ for their ability to change the mitochondrial membrane potential in response to light, resulting in a significant organelle depolarization in cells expressing 4mtSSFO-YFP, while no effect was induced by blue light in control cells. We then analysed in more details the effects of mitochondrial depolarization on mitochondrial Ca2+ uptake using two genetically encoded probes, 4mtD3cpv and mt-aequorin. Both approaches demonstrate that the depolarization of mitochondria triggered by photo-activation of the channel causes, as predicted, a significant reduction in the amplitude of the mitochondrial Ca2+ rise observed upon stimulation of HeLa cells with an IP3-generating agonist. Thus, we generated a tool able to modulate diverse mitochondria activities in a temporary-controlled, reversible (at least in principle) and cell-specific manner, offering an approach to quantitatively investigate mitochondrial role in a large variety of critical cellular processes. In the second part of the thesis, the investigation was focused on the role of Presenilins in Ca2+dyshomeostasis associated to Alzheimer's Disease (AD) using a single cell analysis approach and focusing on the role of AD Presenilin 1 and Presenilin 2 mutations in the modulation of Capacitative Calcium Entry (CCE). AD is the most frequent form of dementia. A small percentage of cases is inherited (Familial AD, FAD) and is due to dominant mutations on three genes, coding for Amyloid Precursor Protein (APP), Presenilin-1 (PS1) and Presenilin-2 (PS2). Mutations in these genes cause alterations in the cleavage of APP by a PS1- or PS2- containing enzyme, named y-secretase complex, thus leading to an increase in the ratio between Abeta42 and Abeta40, the two main peptides eventually derived from APP maturation. This event, in turn, leads to an increased deposition of amyloid plaques, one of the main histopathological feature of AD. To date, the generation of A42 peptides, its oligomers and amyloid plaques is the core of the most widely accepted pathogenic hypothesis for AD, the “Amyloid Cascade Hypothesis”. PS1 and PS2 are ubiquitous 9 transmembrane domains homologous proteins localized mainly in intracellular membranes (Endoplasmic Reticulum, ER, Golgi apparatus, and endosomes) and plasma membrane. Despite being the catalytic core of y-secretase complex, PSs display also some specialized, y-secretase independent activities. On this line, numerous studies reported a role for FAD-linked PS mutations in cellular Ca2+ alterations. Ca2+ is a key second messenger in living cells and it regulates a multitude of cell functions; thus, alterations in its signalling cascade can be detrimental for cell fate. Ca2+ mishandling has been proposed as a causative mechanism for different neurodegenerative diseases and in particular for AD. Although supported by several groups for many years, the Ca2+ hypothesis for AD pathogenesis has never been undisputedly accepted, since some data were clearly conflicting, especially those considering FAD-PS2 mutations. One of the Ca2+ pathway reported to be modulated by different FAD-PSs mutation is the so called CCE or Store Operated Calcium Entry (SOCE). CCE is the mechanism responsible for Ca2+ entry in response to ER Ca2+ depletion. The key molecules responsible for this Ca2+ entry have been identified only recently: STIM and Orai. Basically, Orai forms the channels located in the PM, while STIM is the protein that can “sense” the [Ca2+] in the ER lumen. Upon store depletion, STIM1 changes its distribution from diffuse to clusterized “puncta” and interacts with plasma membrane-located Orai1. Employing a cytosolic Cameleon probe (D3cpV), the CCE variation in SH-SY5Y cells overexpressing PSs or in human FAD and control fibroblasts was investigated. In particular, measuring the effect of PS1-A246, PS2-T122R (in overexpression) and PS1-A246 and PS2N141I (in fibroblasts) FAD-linked mutations, a decrease in both peak and rate of CCE was observed. This phenomenon could be explained by a decrease in STIM1 protein levels, while Orai1 level was not analysed because no antibody sufficiently specific is available. In the over-expression system of SH-SY5Y cells also wild type forms of PS1 and PS2 cause a decrease in CCE and this could be due to the accumulation of the full-length form of the proteins that is thought to be the mediator of the effect

La prima parte di questa tesi si propone di sviluppare nuovi strumenti per esplorare l'omeostasi del calcio (Ca2+) mitocondriale in vivo, migliorando la sonda Cameleon indirizzata ai mitocondri, già presente in laboratorio, e creando un canale regolato dalla luce (Channelrhodopsin) indirizzato a sua volta ai mitocondri. Gli indicatori per il Ca2+ geneticamente codificati (Genetically encoded calcium indicators, GECIs), consentono di eseguire misure quantitative di Ca2+ in diversi modelli sperimentali. Segnali di indirizzamento a specifici organelli possono essere fusi con la sequenza codificante i GECIs, consentendo di misurare variazioni della concentrazione di Ca2+ in diversi compartimenti subcellulari. Inoltre, le sequenze codificanti i GECIs possono essere poste sotto il controllo di promotori tessuto-specifici o inducibili, consentendo così il controllo spaziale e temporale della loro espressione. Diversi tipi di GECIs sono stati creati: nel nostro laboratorio usiamo una classe di sensori Ca2+ basati su FRET, chiamati Cameleon. La microscopia FRET (trasferimento di energia di risonanza Förster) si basa sul trasferimento diretto di energia da una proteina fluorescente (FP), detta donatore, a un'altra FP, detta accettore, in una cellula vivente. Strutturalmente, la sonda Cameleon, è composta da due elementi responsivi per il Ca2+, che modificano l'efficienza di FRET tra le due FPs. All'interno di questa sonda sono infatti presenti due FPs: una proteina fluorescente di colore ciano (CFP), il donatore, e una proteina fluorescente gialla (cpV), l'accettore. I due elementi che rispondono a variazioni di Ca2+ sono la Calmodulina (CaM) e il dominio di legame della calmodulina (M13) della chinasi della catena leggera della miosina. Come anticipato, lo scopo del mio studio è lo sviluppo di sensori molecolari e di nuove metodologie per esprimere le sonde in vivo al fine di esplorare le dinamiche di Ca2+ di particolari organelli in vivo (in particolare nel cervello e nel cuore). Un limite delle sonde Cameleon, particolarmente critico per le applicazioni in vivo, è il basso grado di fluorescenza della CFP, che causa un basso rapporto segnale-rumore ed è caratterizzato da un tempo di vita multi-esponenziale, che indica la presenza di percorsi multipli di decadimento dallo stato eccitato. Recentemente è stata sviluppata una FP più luminosa e più stabile, rispetto alla CFP: mCerulean3. Quest'ultima ha elevata resa quantica di fluorescenza e alta fotostabilità, rendendo questa proteina un buon candidato alla sostituzione del donatore originale nelle sonde Cameleon. Per questo motivo, la CFP è stata sostituita con mCerulean3 in due differenti sonde Cameleon: la sonda citosolica D3cpv e la sonda mitocondriale 4mtD3cpv. Le nuove sonde sono state testate in diversi tipi cellulari: HeLa, cardiomiociti di ratto neonato e neuroni da topi neonati. Sono quindi stati misurati in situ vari parametri indicativi della qualità delle nuove sonde create, quali la luminosità, la fotostabilità, la sensibilità al pH e la costante di dissociazione (Kd), mostrando un netto miglioramento della luminosità e fotostabilità, rispetto alle sonde Cameleon originali. L'unico inconveniente delle nuove sonde è una riduzione del range dinamico, di circa il 20-30%, un parametro molto importante che rende conto della massima variazione del rapporto di fluorescenza emessa alle due lunghezze d'onda in seguito a variazioni di Ca2+. Al fine di sopperire a tale svantaggio, sono stati utilizzati diversi approcci, tra cui l'aggiunta di una sequenza di 16 glicine tra i due elementi responsivi al Ca2+ che ha consentito di recuperare il range dinamico della sonda mitocondriale e di aumentare del 20% quello della sonda citosolica, senza modificare i miglioramenti prima descritti, ottenuti con la semplice sostituzione del donatore. Parallelamente, poiché era stata osservata una scarsa localizzazione mitocondriale a 24 ore dalla trasfezione del 4mtD3cpV, anche la sequenza di indirizzamento è stata modificata (allungando ciascuna delle sequenze originali di 5 minoacidi), diminuendo notevolmente la quantità di sonda espressa erroneamente nel citosol. Come anticipato, l'effetto del pH è stato valutato, evidenziando una stabilità generale delle varie delle sonde tra pH 7 e pH 9. Infine, sono state calcolate le costanti di affinità delle varie sonde mitocondriali. Una doppia affinità per il Ca2+ è stata rilevata: la sonda 4mtD3cpV ha una Kd di 0.06 µM e una di 10.84 µM, mentre la sonda 4mtD3mCerulean3+16 ha una Kd di 0.03 µM e una di 10.7 µM. Per caratterizzare meglio le nuove sonde Cameleon, citosolica e mitocondriale, esse sono state prodotte in E.Coli e purificate per misurare anche in vitro tutti i parametri sopra descritti. Ad oggi sono stati ottenui solo dati preliminari che evidenziano una riduzione del range dinamico passando dall’ambiente citosolico (DR=3) a quello mitocodnriale (DR=2.5). Per quanto riguarda l’affinità per il Ca2+, solo poche concentrazioni di questo ione sono state testate, dando come risultato una Kd singola sia per la sonda mitocondriale che per quella citosolica. Tale dato dovrà essere confermato da ulteriori esperimenti. Tipicamente, le variazioni di Ca2+ rilevate da sonde basate su FRET vengono effettuate utilizzando metodi basati sull'intensità delle due proteine fluorescenti, tuttavia tecniche alternative basate sul tempo di vita della proteina sembrano dare risultati più accurati e robusti. Stiamo perciò iniziando a valutare biofisicamente le sonde Cameleon utilizzando la tecnica FLIM, tecnica che misura quanto tempo una molecola fluorescente resta nello stato eccitato. Il FLIM presenta diversi vantaggi in quanto è totalmente indipendente da fenomeni come il photobleaching, i diversi livelli di espressione, i cambi di fuoco. I dati prelimianri raccolti eveidenziano la presenza di fenomeni di homo-FRET nelle sonde testate, fenomeni che sembrano tuttavia essere meno evidenti nelle sonde in cui la CFP è stata sostituita da mCerulean3. Infine, per esprimere questi due nuove sonde in vivo stiamo applicando tre strategie: i) la creazione di un virus adeno-associato (sierotipo 9) con tropismo cardiaco; ii) la generazione di un altro virus adeno-associato (sierotipo 9) dotato di un promotore neurone specifico (sinapsina) per l'iniezione intracranica; iii) la creazione di topi transgenici. Queste strategie ci permetteranno di effettuare misurazioni in vivo di Ca2+ in diversi tessuti e compartimenti subcellulari. Recentemente, la generazione di un AAV9 per l'espressione del D3mCerulean3 e 4mD3mCerulean3 sotto il controllo di un promotore ubiquitario (CMV) ci ha consentito di osservare un buon livello di espressione nel cuore, iniettando il virus per via intraperitoneale in topi neonati. In conclusione, i risultati finora ottenuti rendono le nuove sonde Cameleon, basate su mCerulean3, una scelta interessante per gli esperimenti in vivo. Come anticipato, al fine di studiare il ruolo dei mitocondri in situ e in vivo, abbiamo anche approfittato di uno strumento optogenetico, le Channelrhodopsine (ChRs), canali appartenente alla famiglia delle opsine. I ChRs sono l'unico tipo di canali ionici, direttamente controllati dalla luce, in grado di indurre depolarizzazione della membrana plasmatica, se opportunamente illuminati. Per l'attivazione, le opsine richiedono il legame con un cofattore organico della vitamina A, chiamato retinale. In collaborazione con il gruppo del Prof. Sekler (Ben-Gurion University-Israel), abbiamo fuso una variante del classico ChR2, detta SSFO (Step stabilized function Opsin), con una sequenza di localizzazione mitocondriale, al fine di creare una canale controllato dalla luce in grado di depolarizzare i mitocondri in modo reversibile (4mt-SSFO). Infatti, le SSFOs sono varianti di ChR in grado di aprirsi, se eccitate con luce blu, e di chiudersi, dopo circa 30 minuti dall'attivazione. É possibile tuttavia accelerare la chiusura del canale utilizzando della luce rossa. Per creare un controllo non funzionante di questo 4mt-SSFO, è stata creata una forma tronca di ChR2(TR) mancante del sito legante il retinale. La localizzazione di SSFO alla membrana mitocondriale interna (IMM) è stato ottenuta fondendo al N-terminale del ChR quattro sequenze di indirizzamento mitocondriale derivate da quella presente nella subunità VIII della citocromo C ossidasi umana. Per verificare la corretta topologia della sonda, sono stati effettuati esperimenti in microscopia confocale, di elettrofisiologia e di fluorescenza sfruttando la variante del 4mtSSFO fusa ad una YFP. Utilizzando vari “quenchers” di fluorescenza e diverse proteasi (Trypan Blue, Proteinase K, Alamethicin) abbiamo dimostrato che il nuovo canale localizza correttamente in IMM con il C-terminale protetto nella matrice mitocondriale. Il secondo passo è stata la verifica della funzionalità dei nuovi costrutti 4mtSSFO-YFP in situ, verificando la loro capacità di modificare il potenziale di membrana mitocondriale in risposta alla luce. Confermata la funzionalità, abbiamo poi analizzato più in dettaglio l'effetto della depolarizzazione mitocondriale sulla capacità del mitocondrio di regolare l'ingresso di Ca2+, utilizzando due sonde geneticamente codificate, il 4mtD3cpv e l'aequorina indirizzata ai mitocondri. Entrambi gli approcci dimostrano che la depolarizzazione dei mitocondri, innescata dalla fotoattivazione del canale, induce, come atteso, una significativa riduzione dell’entrata del Ca2+ all'interno del mitocondrio. L'ingresso di Ca2+ in questo organello è stato indotto stimolando cellule HeLa con un agonista producente IP3. Concludendo, i dati ottenuti sino ad ora confermano la generazione di uno strumento molecolare in grado di modulare l'attività dei mitocondri con precisione temporale e in modo reversibile (almeno in linea di principio) e specifico, offrendo così un nuovo approccio per determinare quantitativamente il ruolo mitocondriale in una grande varietà di processi cellulari critici. Nella seconda parte della mia tesi, mi sono concentrata sullo studio del ruolo delle Preseniline nell'alterazione dell'omeostasi del Ca2+ nella malattia di Alzheimer (AD), utilizzando un approccio a singola cellula e concentrandomi sul ruolo delle mutazioni presenti in Presenilina 1 e Presenilina 2 correlate ad AD nella regolazione dell'ingresso capacitativo di calcio (CCE). AD è la forma più frequente di demenza. Una piccola percentuale di casi è ereditaria (Familial AD, FAD) ed è dovuta a mutazioni dominanti in tre geni, che codificano per la proteina precursore dell'amiloide (APP), Presenilina-1 (PS1) e presenilina-2 (PS2). Mutazioni in questi geni provocano alterazioni nel taglio di APP mediato da un enzima, detto complesso y-secretasico, che annovera tra i suoi componenti PS1 e PS2, e che è in grado di causare un aumento del rapporto tra Abeta42 e Abeta40, i due peptidi derivati dalla maturazione di APP. La generazione di tali peptidi, a sua volta, aumenterebbe la deposizione di placche amiloidi, una delle caratteristiche istopatologiche principali dell'AD. Ad oggi, la generazione dei peptidi Abeta42, dei suoi oligomeri e delle placche amiloidi, costituisce il cuore dell’ipotesi patogenetica più accreditata per AD, “l'ipotesi della cascata amiloide". PS1 e PS2 sono proteine omologhe e ubiquitarie formate da 9 domini trans-membrana. Esse sono localizzate prevalentemente nelle membrane interne di reticolo endoplasmatico (ER), apparato di Golgi, endosomi e nella membrana plasmatica (PM). Pur essendo il nucleo catalizzatore della y-secretasi, le PSs svolgono anche ruoli indipendenti dall'attività di questo enzima, tra cui la regolazione dell'omeostasi del Ca2+. Quest'ultimo fenomeno infatti risulta variamente alterato in presenza di mutazioni FAD nelle PSs. Il Ca2+ è un secondo messaggero intracellulare chiave nelle cellule viventi e regola una moltitudine di funzioni cellulari, pertanto alterazioni nelle sue vie di segnale possono essere dannose per il destino della cellula. Alterazioni nell'omeostasi del Ca2+ sono state proposte come meccanismo causale per diverse malattie neurodegenerative e in particolare per l'AD. Sebbene supportata da diversi lavori, l'ipotesi del Ca2+ per la patogenesi dell'AD è stata a lungo messa in discussione, a causa dello scarso consenso della comunità scientifica sull'effetto di mutazioni in PSs nella regolazione di questo ione. Uno dei meccanismi che sembra essere modulato da diverse mutazioni FAD associate a PSs, è il cosiddetto CCE, o Store Operated Calcium Entry (SOCE). Il CCE è il meccanismo responsabile dell'influsso di Ca2+ all'interno della cellula in risposta allo svuotamento dell'ER. Le molecole chiave responsabili del CCE sono state identificate solo di recente: STIM e Orai. Brevemente, Orai1 forma i canali situati in PM, mentre STIM1 è la proteina che "sente" la [Ca2+] nel lume dell'ER. Quando l'ER si svuota, STIM1 cambia la sua distribuzione diffusa, oligomerizza in punte (puncta) discrete che, a questo punto, sono in grado di interagire con Orai1 a livello della PM. Utilizzando una sonda citosolica Cameleon (D3cpV), ho valutato le variazione di CCE in cellule SH-SY5Y sovra-esprimenti PSs e in fibroblasti derivati da pazienti FAD o da controlli sani. In particolare, le mutazioni FAD, PS1-A246 e PS2-T122R (in sovra-espressione) e PS1-A246 e PS2-N141I (in fibroblasti) causano una diminuzione del CCE, sia della sua entità che della sua velocità di attivazione. Questo fenomeno può essere spiegato da un diminuito livello di STIM1 nei campioni FAD rispetto ai controlli, mentre non è stato possibile valutare i livelli proteici di Orai, poiché non è disponibile un anticorpo abbastanza specifico. Negli esperimenti di sovra-espressione, anche la forma wild type di PS1 e PS2 causa una diminuzione del CCE, fenomeno probabilmente dovuto all'accumulo della forma lunga (non tagliata) delle PSs, forma che sembra essere responsabile degli effetti mediati dalle PSs sull'omeostasi del Ca2+

Development of new tools to explore organelle calcium dynamics in vivo: a new fret-based calcium sensor and a mitochondria targeted channelrhodopsin / Greotti, Elisa. - (2015 Feb 01).

Development of new tools to explore organelle calcium dynamics in vivo: a new fret-based calcium sensor and a mitochondria targeted channelrhodopsin

Greotti, Elisa
2015

Abstract

La prima parte di questa tesi si propone di sviluppare nuovi strumenti per esplorare l'omeostasi del calcio (Ca2+) mitocondriale in vivo, migliorando la sonda Cameleon indirizzata ai mitocondri, già presente in laboratorio, e creando un canale regolato dalla luce (Channelrhodopsin) indirizzato a sua volta ai mitocondri. Gli indicatori per il Ca2+ geneticamente codificati (Genetically encoded calcium indicators, GECIs), consentono di eseguire misure quantitative di Ca2+ in diversi modelli sperimentali. Segnali di indirizzamento a specifici organelli possono essere fusi con la sequenza codificante i GECIs, consentendo di misurare variazioni della concentrazione di Ca2+ in diversi compartimenti subcellulari. Inoltre, le sequenze codificanti i GECIs possono essere poste sotto il controllo di promotori tessuto-specifici o inducibili, consentendo così il controllo spaziale e temporale della loro espressione. Diversi tipi di GECIs sono stati creati: nel nostro laboratorio usiamo una classe di sensori Ca2+ basati su FRET, chiamati Cameleon. La microscopia FRET (trasferimento di energia di risonanza Förster) si basa sul trasferimento diretto di energia da una proteina fluorescente (FP), detta donatore, a un'altra FP, detta accettore, in una cellula vivente. Strutturalmente, la sonda Cameleon, è composta da due elementi responsivi per il Ca2+, che modificano l'efficienza di FRET tra le due FPs. All'interno di questa sonda sono infatti presenti due FPs: una proteina fluorescente di colore ciano (CFP), il donatore, e una proteina fluorescente gialla (cpV), l'accettore. I due elementi che rispondono a variazioni di Ca2+ sono la Calmodulina (CaM) e il dominio di legame della calmodulina (M13) della chinasi della catena leggera della miosina. Come anticipato, lo scopo del mio studio è lo sviluppo di sensori molecolari e di nuove metodologie per esprimere le sonde in vivo al fine di esplorare le dinamiche di Ca2+ di particolari organelli in vivo (in particolare nel cervello e nel cuore). Un limite delle sonde Cameleon, particolarmente critico per le applicazioni in vivo, è il basso grado di fluorescenza della CFP, che causa un basso rapporto segnale-rumore ed è caratterizzato da un tempo di vita multi-esponenziale, che indica la presenza di percorsi multipli di decadimento dallo stato eccitato. Recentemente è stata sviluppata una FP più luminosa e più stabile, rispetto alla CFP: mCerulean3. Quest'ultima ha elevata resa quantica di fluorescenza e alta fotostabilità, rendendo questa proteina un buon candidato alla sostituzione del donatore originale nelle sonde Cameleon. Per questo motivo, la CFP è stata sostituita con mCerulean3 in due differenti sonde Cameleon: la sonda citosolica D3cpv e la sonda mitocondriale 4mtD3cpv. Le nuove sonde sono state testate in diversi tipi cellulari: HeLa, cardiomiociti di ratto neonato e neuroni da topi neonati. Sono quindi stati misurati in situ vari parametri indicativi della qualità delle nuove sonde create, quali la luminosità, la fotostabilità, la sensibilità al pH e la costante di dissociazione (Kd), mostrando un netto miglioramento della luminosità e fotostabilità, rispetto alle sonde Cameleon originali. L'unico inconveniente delle nuove sonde è una riduzione del range dinamico, di circa il 20-30%, un parametro molto importante che rende conto della massima variazione del rapporto di fluorescenza emessa alle due lunghezze d'onda in seguito a variazioni di Ca2+. Al fine di sopperire a tale svantaggio, sono stati utilizzati diversi approcci, tra cui l'aggiunta di una sequenza di 16 glicine tra i due elementi responsivi al Ca2+ che ha consentito di recuperare il range dinamico della sonda mitocondriale e di aumentare del 20% quello della sonda citosolica, senza modificare i miglioramenti prima descritti, ottenuti con la semplice sostituzione del donatore. Parallelamente, poiché era stata osservata una scarsa localizzazione mitocondriale a 24 ore dalla trasfezione del 4mtD3cpV, anche la sequenza di indirizzamento è stata modificata (allungando ciascuna delle sequenze originali di 5 minoacidi), diminuendo notevolmente la quantità di sonda espressa erroneamente nel citosol. Come anticipato, l'effetto del pH è stato valutato, evidenziando una stabilità generale delle varie delle sonde tra pH 7 e pH 9. Infine, sono state calcolate le costanti di affinità delle varie sonde mitocondriali. Una doppia affinità per il Ca2+ è stata rilevata: la sonda 4mtD3cpV ha una Kd di 0.06 µM e una di 10.84 µM, mentre la sonda 4mtD3mCerulean3+16 ha una Kd di 0.03 µM e una di 10.7 µM. Per caratterizzare meglio le nuove sonde Cameleon, citosolica e mitocondriale, esse sono state prodotte in E.Coli e purificate per misurare anche in vitro tutti i parametri sopra descritti. Ad oggi sono stati ottenui solo dati preliminari che evidenziano una riduzione del range dinamico passando dall’ambiente citosolico (DR=3) a quello mitocodnriale (DR=2.5). Per quanto riguarda l’affinità per il Ca2+, solo poche concentrazioni di questo ione sono state testate, dando come risultato una Kd singola sia per la sonda mitocondriale che per quella citosolica. Tale dato dovrà essere confermato da ulteriori esperimenti. Tipicamente, le variazioni di Ca2+ rilevate da sonde basate su FRET vengono effettuate utilizzando metodi basati sull'intensità delle due proteine fluorescenti, tuttavia tecniche alternative basate sul tempo di vita della proteina sembrano dare risultati più accurati e robusti. Stiamo perciò iniziando a valutare biofisicamente le sonde Cameleon utilizzando la tecnica FLIM, tecnica che misura quanto tempo una molecola fluorescente resta nello stato eccitato. Il FLIM presenta diversi vantaggi in quanto è totalmente indipendente da fenomeni come il photobleaching, i diversi livelli di espressione, i cambi di fuoco. I dati prelimianri raccolti eveidenziano la presenza di fenomeni di homo-FRET nelle sonde testate, fenomeni che sembrano tuttavia essere meno evidenti nelle sonde in cui la CFP è stata sostituita da mCerulean3. Infine, per esprimere questi due nuove sonde in vivo stiamo applicando tre strategie: i) la creazione di un virus adeno-associato (sierotipo 9) con tropismo cardiaco; ii) la generazione di un altro virus adeno-associato (sierotipo 9) dotato di un promotore neurone specifico (sinapsina) per l'iniezione intracranica; iii) la creazione di topi transgenici. Queste strategie ci permetteranno di effettuare misurazioni in vivo di Ca2+ in diversi tessuti e compartimenti subcellulari. Recentemente, la generazione di un AAV9 per l'espressione del D3mCerulean3 e 4mD3mCerulean3 sotto il controllo di un promotore ubiquitario (CMV) ci ha consentito di osservare un buon livello di espressione nel cuore, iniettando il virus per via intraperitoneale in topi neonati. In conclusione, i risultati finora ottenuti rendono le nuove sonde Cameleon, basate su mCerulean3, una scelta interessante per gli esperimenti in vivo. Come anticipato, al fine di studiare il ruolo dei mitocondri in situ e in vivo, abbiamo anche approfittato di uno strumento optogenetico, le Channelrhodopsine (ChRs), canali appartenente alla famiglia delle opsine. I ChRs sono l'unico tipo di canali ionici, direttamente controllati dalla luce, in grado di indurre depolarizzazione della membrana plasmatica, se opportunamente illuminati. Per l'attivazione, le opsine richiedono il legame con un cofattore organico della vitamina A, chiamato retinale. In collaborazione con il gruppo del Prof. Sekler (Ben-Gurion University-Israel), abbiamo fuso una variante del classico ChR2, detta SSFO (Step stabilized function Opsin), con una sequenza di localizzazione mitocondriale, al fine di creare una canale controllato dalla luce in grado di depolarizzare i mitocondri in modo reversibile (4mt-SSFO). Infatti, le SSFOs sono varianti di ChR in grado di aprirsi, se eccitate con luce blu, e di chiudersi, dopo circa 30 minuti dall'attivazione. É possibile tuttavia accelerare la chiusura del canale utilizzando della luce rossa. Per creare un controllo non funzionante di questo 4mt-SSFO, è stata creata una forma tronca di ChR2(TR) mancante del sito legante il retinale. La localizzazione di SSFO alla membrana mitocondriale interna (IMM) è stato ottenuta fondendo al N-terminale del ChR quattro sequenze di indirizzamento mitocondriale derivate da quella presente nella subunità VIII della citocromo C ossidasi umana. Per verificare la corretta topologia della sonda, sono stati effettuati esperimenti in microscopia confocale, di elettrofisiologia e di fluorescenza sfruttando la variante del 4mtSSFO fusa ad una YFP. Utilizzando vari “quenchers” di fluorescenza e diverse proteasi (Trypan Blue, Proteinase K, Alamethicin) abbiamo dimostrato che il nuovo canale localizza correttamente in IMM con il C-terminale protetto nella matrice mitocondriale. Il secondo passo è stata la verifica della funzionalità dei nuovi costrutti 4mtSSFO-YFP in situ, verificando la loro capacità di modificare il potenziale di membrana mitocondriale in risposta alla luce. Confermata la funzionalità, abbiamo poi analizzato più in dettaglio l'effetto della depolarizzazione mitocondriale sulla capacità del mitocondrio di regolare l'ingresso di Ca2+, utilizzando due sonde geneticamente codificate, il 4mtD3cpv e l'aequorina indirizzata ai mitocondri. Entrambi gli approcci dimostrano che la depolarizzazione dei mitocondri, innescata dalla fotoattivazione del canale, induce, come atteso, una significativa riduzione dell’entrata del Ca2+ all'interno del mitocondrio. L'ingresso di Ca2+ in questo organello è stato indotto stimolando cellule HeLa con un agonista producente IP3. Concludendo, i dati ottenuti sino ad ora confermano la generazione di uno strumento molecolare in grado di modulare l'attività dei mitocondri con precisione temporale e in modo reversibile (almeno in linea di principio) e specifico, offrendo così un nuovo approccio per determinare quantitativamente il ruolo mitocondriale in una grande varietà di processi cellulari critici. Nella seconda parte della mia tesi, mi sono concentrata sullo studio del ruolo delle Preseniline nell'alterazione dell'omeostasi del Ca2+ nella malattia di Alzheimer (AD), utilizzando un approccio a singola cellula e concentrandomi sul ruolo delle mutazioni presenti in Presenilina 1 e Presenilina 2 correlate ad AD nella regolazione dell'ingresso capacitativo di calcio (CCE). AD è la forma più frequente di demenza. Una piccola percentuale di casi è ereditaria (Familial AD, FAD) ed è dovuta a mutazioni dominanti in tre geni, che codificano per la proteina precursore dell'amiloide (APP), Presenilina-1 (PS1) e presenilina-2 (PS2). Mutazioni in questi geni provocano alterazioni nel taglio di APP mediato da un enzima, detto complesso y-secretasico, che annovera tra i suoi componenti PS1 e PS2, e che è in grado di causare un aumento del rapporto tra Abeta42 e Abeta40, i due peptidi derivati dalla maturazione di APP. La generazione di tali peptidi, a sua volta, aumenterebbe la deposizione di placche amiloidi, una delle caratteristiche istopatologiche principali dell'AD. Ad oggi, la generazione dei peptidi Abeta42, dei suoi oligomeri e delle placche amiloidi, costituisce il cuore dell’ipotesi patogenetica più accreditata per AD, “l'ipotesi della cascata amiloide". PS1 e PS2 sono proteine omologhe e ubiquitarie formate da 9 domini trans-membrana. Esse sono localizzate prevalentemente nelle membrane interne di reticolo endoplasmatico (ER), apparato di Golgi, endosomi e nella membrana plasmatica (PM). Pur essendo il nucleo catalizzatore della y-secretasi, le PSs svolgono anche ruoli indipendenti dall'attività di questo enzima, tra cui la regolazione dell'omeostasi del Ca2+. Quest'ultimo fenomeno infatti risulta variamente alterato in presenza di mutazioni FAD nelle PSs. Il Ca2+ è un secondo messaggero intracellulare chiave nelle cellule viventi e regola una moltitudine di funzioni cellulari, pertanto alterazioni nelle sue vie di segnale possono essere dannose per il destino della cellula. Alterazioni nell'omeostasi del Ca2+ sono state proposte come meccanismo causale per diverse malattie neurodegenerative e in particolare per l'AD. Sebbene supportata da diversi lavori, l'ipotesi del Ca2+ per la patogenesi dell'AD è stata a lungo messa in discussione, a causa dello scarso consenso della comunità scientifica sull'effetto di mutazioni in PSs nella regolazione di questo ione. Uno dei meccanismi che sembra essere modulato da diverse mutazioni FAD associate a PSs, è il cosiddetto CCE, o Store Operated Calcium Entry (SOCE). Il CCE è il meccanismo responsabile dell'influsso di Ca2+ all'interno della cellula in risposta allo svuotamento dell'ER. Le molecole chiave responsabili del CCE sono state identificate solo di recente: STIM e Orai. Brevemente, Orai1 forma i canali situati in PM, mentre STIM1 è la proteina che "sente" la [Ca2+] nel lume dell'ER. Quando l'ER si svuota, STIM1 cambia la sua distribuzione diffusa, oligomerizza in punte (puncta) discrete che, a questo punto, sono in grado di interagire con Orai1 a livello della PM. Utilizzando una sonda citosolica Cameleon (D3cpV), ho valutato le variazione di CCE in cellule SH-SY5Y sovra-esprimenti PSs e in fibroblasti derivati da pazienti FAD o da controlli sani. In particolare, le mutazioni FAD, PS1-A246 e PS2-T122R (in sovra-espressione) e PS1-A246 e PS2-N141I (in fibroblasti) causano una diminuzione del CCE, sia della sua entità che della sua velocità di attivazione. Questo fenomeno può essere spiegato da un diminuito livello di STIM1 nei campioni FAD rispetto ai controlli, mentre non è stato possibile valutare i livelli proteici di Orai, poiché non è disponibile un anticorpo abbastanza specifico. Negli esperimenti di sovra-espressione, anche la forma wild type di PS1 e PS2 causa una diminuzione del CCE, fenomeno probabilmente dovuto all'accumulo della forma lunga (non tagliata) delle PSs, forma che sembra essere responsabile degli effetti mediati dalle PSs sull'omeostasi del Ca2+
1-feb-2015
The first part of this thesis aims to develop new tools to explore mitochondrial Ca2+ dynamic in vivo by the improvement of a mitochondria targeting Cameleon probes and by creating a mitochondria targeted Channelrhodopsin. Genetically encoded calcium indicators (GECIs) allow quantitative Ca2+ measurements in different experimental models. Organelle-specific targeting signals are fused with the GECI’s sequence, achieving selective targeting to a specific organelle or cytoplasmic domain. Moreover, GECI’s coding sequences can be placed under the control of tissue specific or inducible promoters, allowing spatial and temporal control of their expression. Different types of GECIs have been created: in our laboratory we use a class of FRET-based Ca2+ sensors, called Cameleons. FRET (Förster resonance energy transfer) microscopy detects the direct transfer of energy from a donor to an acceptor fluorescence protein (FP) in a living cell. Cameleon structure consists of two Ca2+-responsive elements that alter the efficiency of FRET between two FPs: a cyan fluorescent protein (CFP), the donor, and a yellow fluorescent protein (cpV), the acceptor. The two Ca2+-responsive elements are Calmodulin (CaM) and the CaM-binding domain of myosin light chain kinase. As reported in the beginning, the aim of this study is to develop novel molecular sensors and new methodologies to express the probes in vivo in intact tissues as well as in organisms in order to explore organelle Ca2+ dynamics in vivo (in particularly in brain and heart). One of the limitations of Cameleon probes, especially critical for in vivo applications, is the low fluorescence of CFP, reducing the maximal obtainable signal-to-noise ratio, and a multi-exponential lifetime, indicating the presence of multiple excited-state decay pathways. Recently, a brighter and more stable FP, compared to CFP, has been developed: mCerulean3. It has high fluorescence quantum yield and high photostability, making this protein a good donor candidate in Cameleon probes. For this reason, CFP has been replaced with mCerulean3 in two different Cameleons: the cytosolic D3cpv and the mitochondria-targeted probe named 4mtD3cpv. The new probes have been tested in different cell types: HeLa, neonatal rat cardiomyocytes and neonatal mouse neurons. The brightness, the photostability, the pH-sensitivity and the dissociation constant (Kd) of the new probes have also been measured in situ and the data show a clear improvement in brightness and in photostability, compared to the original Cameleons, in both cytosolic and mitochondrial probes. The only drawback of the new probes is a reduced amplitude (about 20-30%) in the maximum change in the fluorescence emission ratio due to Ca2+ binding (dynamic range). In order to extend the dynamic range different approaches have been used. The addition of 16 glycines between the two Ca2+ responsive elements allowed us to generate a new cytosolic probe (D3mCerulean3+16) with an increased dynamic range (+ 20%). Similarly, we have modified the mitochondrial probe, starting from the targeting sequence, each N-terminal sequence of COX-VIII (subunit VIII of human cytochrome C oxidase) was elongated of 5 aminoacids. Indeed, 24 h after transfection a significant mis-localization in the cytosol was observed with the original probe, while the mis-targeting of the modified targeting sequence containing probe was decreased. Moreover, the reduction in the dynamic range due to the mCerulean3 presence was almost fully recovered adding the 16 glycines linker. We than analysed the effect of pH, observing a general stability of all the probe variants in the pH range tested. Finally, we evaluated the Ca2+ affinity of all the mitochondrial variants generated so far, obtaining a Kd of 0.06 µM and one of 10.84 µM in 4mtD3cpV, a Kd of 6,5 µM in 4mtD3mCerulean3 and a Kd of 0.03 µM and one of 10.7 µM in 4mtD3mCerulean3+16. To better characterize the new cytosolic and mitochondrial Cameleon probes, we purified the proteins expressed in E.Coli in order to measure also in vitro all the parameters described above. Up to now only preliminary data have been obtained, however a comparison of in situ and in vitro data suggests that the DR calculated for cytosolic probes is about 3, while that for a mitochondria like environment is about 2.5. Concerning the Ca2+ affinity, just few [Ca2+] concentrations have been tested so far, therefore all the mitochondrial and cytosolic probes display a single Kd. However, further experiments are required to confirm the in vitro calculated Kd. In parallel, we are also assessing another method to measure Ca2+ with FRET-GECIs, as an alternative of the classical intensity-based method. We are indeed employing FLIM technique that measures the lifetime of FPs (the time the molecule spend in the exited state), which is totally independent from phenomena such as probe photobleaching, expression level, image shading. Preliminary results in cells expressing all the Camelon probes described so far, suggest the presence of homo-FRET phenomena and mCerulean3-based Ca2+ sensors seem to be less affected by them. Finally, to express the new probes in vivo we are testing three strategies: i) adeno-associated virus (serotype 9) with cardiac tropism viral vectors; ii) adeno-associated virus (serotype 9) with neuron-specific promoters (synapsin promoter) for intracranial injection; iii) transgenic mice. These strategies will allow us to perform in vivo Ca2+ measurements in different tissues and subcellular compartments. We have just generated the AAV9 for the expression of the D3mCerulean3 and 4mD3mCerulean3 under the control of CMV promoter. A good expression levels in heart was obtained through intraperiotneal injection of neonatal mice. In conclusion, the results obtained so far make the mCerulean3-based Cameleons an attractive choice for in vivo experiments. To study the role of mitochondria in situ and in vivo, we also took advantage of an optogenetic tool: Channel Rhodopsins (ChRs). ChRs represent the only type of ion channels directly gated by light. When excited by light, ChRs open and depolarize the plasma membrane. For activation, opsins require binding of retinal, a vitamin A–related organic cofactor. In collaboration with Prof. Sekler’s group (Ben-Gurion University-Israel), we have developed a new mitochondria-targeted ChR, called mitochondrial Stabilized Step Function Opsin (4mt-SSFO). This ChR variant was modified to stabilize the conducting state of the channel: SSFO deactivation occurs in 30 minutes after a brief pulse of activating blue light (460-480 nm). It has also been reported the possibility to terminate the photocurrents with red light. To create a non-functional control, a truncated form Chr2(TR) lacking retinal binding site was generated. The targeting of proteins to the inner mitochondrial membrane (IMM) was obtained fusing four signal sequences, derived from human cytochrome C oxidase subunit VIII sequence, to the N-terminus of ChR. To verify the correct topology of the probe, confocal microscopy, elecrtophisiological recordings and fluorescence quenching experiments were carried out. When 4mtSSFO-YFP is properly inserted in the IMM, its C-terminal YFP tag should face the mitochondrial matrix. Indeed, the application of proteinase K to Digitonin permeabilized cells did not cause a significant reduction of 4mtChR2B-YFP signal, while that of N33D3cpv (a probe in which the YFP is located on the cytoplasmic surface of the OMM) is completely abolished. Trypan blue addition, that is permeable across the OMM, but not the IMM, did not affect the fluorescence of 4mtSSFO-YFP or that of the matrix located Cameleon 4mtD3cpv. The 4mtD3cpv fluorescence however was totally lost after alamethicin application that permeabilizes both mitochondrial membranes and releases all matrix proteins into the medium, while the fluorescence of 4mtSSFO-YFP was not affected by the latter treatment, as expected for a membrane bound protein. Taken together these data are consistent with a proper IMM localization. The new mitochondrial 4mtSSFO-YFP constructs were then tested in situ for their ability to change the mitochondrial membrane potential in response to light, resulting in a significant organelle depolarization in cells expressing 4mtSSFO-YFP, while no effect was induced by blue light in control cells. We then analysed in more details the effects of mitochondrial depolarization on mitochondrial Ca2+ uptake using two genetically encoded probes, 4mtD3cpv and mt-aequorin. Both approaches demonstrate that the depolarization of mitochondria triggered by photo-activation of the channel causes, as predicted, a significant reduction in the amplitude of the mitochondrial Ca2+ rise observed upon stimulation of HeLa cells with an IP3-generating agonist. Thus, we generated a tool able to modulate diverse mitochondria activities in a temporary-controlled, reversible (at least in principle) and cell-specific manner, offering an approach to quantitatively investigate mitochondrial role in a large variety of critical cellular processes. In the second part of the thesis, the investigation was focused on the role of Presenilins in Ca2+dyshomeostasis associated to Alzheimer's Disease (AD) using a single cell analysis approach and focusing on the role of AD Presenilin 1 and Presenilin 2 mutations in the modulation of Capacitative Calcium Entry (CCE). AD is the most frequent form of dementia. A small percentage of cases is inherited (Familial AD, FAD) and is due to dominant mutations on three genes, coding for Amyloid Precursor Protein (APP), Presenilin-1 (PS1) and Presenilin-2 (PS2). Mutations in these genes cause alterations in the cleavage of APP by a PS1- or PS2- containing enzyme, named y-secretase complex, thus leading to an increase in the ratio between Abeta42 and Abeta40, the two main peptides eventually derived from APP maturation. This event, in turn, leads to an increased deposition of amyloid plaques, one of the main histopathological feature of AD. To date, the generation of A42 peptides, its oligomers and amyloid plaques is the core of the most widely accepted pathogenic hypothesis for AD, the “Amyloid Cascade Hypothesis”. PS1 and PS2 are ubiquitous 9 transmembrane domains homologous proteins localized mainly in intracellular membranes (Endoplasmic Reticulum, ER, Golgi apparatus, and endosomes) and plasma membrane. Despite being the catalytic core of y-secretase complex, PSs display also some specialized, y-secretase independent activities. On this line, numerous studies reported a role for FAD-linked PS mutations in cellular Ca2+ alterations. Ca2+ is a key second messenger in living cells and it regulates a multitude of cell functions; thus, alterations in its signalling cascade can be detrimental for cell fate. Ca2+ mishandling has been proposed as a causative mechanism for different neurodegenerative diseases and in particular for AD. Although supported by several groups for many years, the Ca2+ hypothesis for AD pathogenesis has never been undisputedly accepted, since some data were clearly conflicting, especially those considering FAD-PS2 mutations. One of the Ca2+ pathway reported to be modulated by different FAD-PSs mutation is the so called CCE or Store Operated Calcium Entry (SOCE). CCE is the mechanism responsible for Ca2+ entry in response to ER Ca2+ depletion. The key molecules responsible for this Ca2+ entry have been identified only recently: STIM and Orai. Basically, Orai forms the channels located in the PM, while STIM is the protein that can “sense” the [Ca2+] in the ER lumen. Upon store depletion, STIM1 changes its distribution from diffuse to clusterized “puncta” and interacts with plasma membrane-located Orai1. Employing a cytosolic Cameleon probe (D3cpV), the CCE variation in SH-SY5Y cells overexpressing PSs or in human FAD and control fibroblasts was investigated. In particular, measuring the effect of PS1-A246, PS2-T122R (in overexpression) and PS1-A246 and PS2N141I (in fibroblasts) FAD-linked mutations, a decrease in both peak and rate of CCE was observed. This phenomenon could be explained by a decrease in STIM1 protein levels, while Orai1 level was not analysed because no antibody sufficiently specific is available. In the over-expression system of SH-SY5Y cells also wild type forms of PS1 and PS2 cause a decrease in CCE and this could be due to the accumulation of the full-length form of the proteins that is thought to be the mediator of the effect
Cameleon, Calcium probe, channelrhodopsin, mitochondria, Alzheimer, Presenilins
Development of new tools to explore organelle calcium dynamics in vivo: a new fret-based calcium sensor and a mitochondria targeted channelrhodopsin / Greotti, Elisa. - (2015 Feb 01).
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