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Lazzarini, Elisabetta (2015) Diagnostic Implications of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Genetic Testing. [Tesi di dottorato]

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Tesi non accessible fino a 03 Febbraio 2018 per motivi correlati alla proprietà intellettuale.
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Abstract (inglese)

Background & Aims: Arrhythmogenic Cardiomyopathy (AC) is a rare inherited heart muscle disease associated with mutations in genes encoding mainly components of the cardiac desmosome. We performed a comprehensive study of genetic variants in a cohort of AC subjects and the assessment of Next Generation Sequencing (NGS) strategies for molecular diagnosis of AC.
Methods: Ninety-nine unrelated index cases, of which 26 sudden cardiac death cases, underwent genetic screening for 5 desmosomal genes by denaturing high performance liquid chromatography and direct sequencing, whereas 46 probands were additionally screened for 3 extra desmosomal genes. A complementary analysis for copy number variants (CNVs) was performed by multiplex ligation-dependent probe amplification and quantitative real-time PCR in the entire cohort. A 4-step variant filtering strategy based on mutation type, frequency, evolutionary conservation and in silico analysis, was used. Whole Exome and Targeted NGS strategies were performed on Illumina platforms in order to test methods efficacy.
Results: Screening of 8 AC genes and subsequent 4-step variants filtering identified 37 different point desmosomal mutations in 42 AC probands (42%). The most frequently mutated genes resulted PKP2 and DSP, with “radical” mutation type accounting for the 80% of the PKP2 variants. No pathogenic mutations were identified in the extra desmosomal genes analyzed. CNVs analysis further revealed 3 different large genomic rearrangements in 5 probands (4%), increasing to 46 (46%) the number of positively genotyped patients. PKP2 and DSP single mutation accounted respectively for 20% and 11% of the cohort, with DSP carriers showing a higher risk of sudden cardiac death. Eight multiple mutations carriers were observed (8%). NGS approaches identified 4 variants in extra desmosomal genes allowing a differential diagnosis in 4 patients.
Conclusions: A fine variant filtering avoids overrepresentation of putative pathogenic mutations and shows that radical and missense mutations should be equally interpreted with great caution in the setting of clinical diagnosis. NGS and CNVs analysis increased significantly the diagnostic yield in AC genetic testing. The genetics of AC is more complex than previously appreciated, with frequent requirement for more than one ‘hit’ for penetrant disease.

Abstract (italiano)

Introduzione & Scopo: La Cardiomiopatia Aritmogena (AC) è una malattia rara del muscolo cardiaco associata a mutazioni a carico di geni che codificano principalmente per componenti del desmosoma cardiaco. Abbiamo realizzato l`analisi genetica in una coorte di soggetti affetti da AC e lo sviluppo di strategie in Next Generation Sequencing (NGS) per la diagnosi molecolare di AC.
Metodi: Novantanove casi indice, di cui 26 soggetti di morte improvvisa, sono stati sottoposti a screening genetico per 5 geni desmosomiali mediante cromatografia denaturante in fase liquida ad alto rendimento e sequenziamento diretto, 46 probandi sono stati analizzati anche per 3 geni extra desmosomiali. Abbiamo inoltre ricercato nell`intera popolazione varianti del numero di copie (CNVs) mediante la tecnica MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) e PCR quantitativa. La strategia di filtraggio si è basata sul tipo di mutazione, frequenza, conservazione, e analisi in silico. Gli approcci NGS “Whole Exome” e “Targeted” sono stati eseguiti su piattaforme Illumina.
Risultati: L`analisi di 8 geni associati alla AC e il successivo filtraggio delle varianti ha individuato 37 diverse mutazioni puntiformi in 42 soggetti (42%). I geni più frequentemente mutati sono la PKP2 e la DSP, le mutazioni “radicali” costituiscono l`80% delle varianti della PKP2. Non sono state riscontrate mutazioni patogene nei geni extra desmosomiali studiati. La ricerca di CNVs ha identificato 3 diversi riarrangiamenti cromosomici in 5 probandi (4%), portando a 46 (46%) i soggetti genotipo positivi. Si sono osservate mutazioni singole nei geni PKP2 e DSP nel 20% e nell`11% dei soggetti, i portatori di mutazioni nella DSP presentano un rischio maggiore di morte improvvisa, 8 (8%) soggetti presentano mutazioni multiple. Le analisi mediante NGS hanno indentificato 4 varianti in geni extra desmosomiali permettendo la diagnosi differenziale in 4 pazienti.
Conclusioni: La diagnosi molecolare in ambito clinico rende necessaria un`attenta interpretazione del potenziale patogeno tanto delle mutazioni missenso quanto di quelle radicali soprattutto dopo il cospicuo aumento di varianti identificate con NGS e la ricerca di CNVs. La base genetica di AC è molto più complessa di quanto finora apprezzato, con una frequente presenza di più di una mutazione per una penetranza completa della malattia.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Pilichou, Kalliopi
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 27 > scuole 27 > SCIENZE MEDICHE, CLINICHE E SPERIMENTALI > SCIENZE CARDIOVASCOLARI
Data di deposito della tesi:03 Febbraio 2015
Anno di Pubblicazione:03 Febbraio 2015
Parole chiave (italiano / inglese):Arrhythmogenic Cardiomyopathy
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/08 Anatomia patologica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Cardiologiche, Toraciche e Vascolari
Codice ID:8018
Depositato il:12 Nov 2015 16:45
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