Protein-protein interactions mediate a large number of important regulatory pathways in the organism and also play a central role in many pathologies. Protein surface recognition provides a powerful tool for the regulation of those protein-protein interactions. Gold nanoparticles offer a suitable platform for multi-functionalization with a wide range of biological ligands for the selective binding and detection of biological targets such as proteins. In particular, gold nanoparticles functionalized with peptide fragments are very attractive for that purpose, since peptides contain all necessary chemical information to interact with natural proteins. During the past years, self-assembly, i.e. the spontaneous organization of molecules into ordered aggregates, has emerged as the most attractive way to develop highly complex nanosized systems. Au NPs containing 1,4,7-triazacyclononane (TACN)·Zn(II) head groups (Au NP 1) have been shown to be attractive scaffolds for the formation of multivalent supramolecular structures. In this PhD-project the self-assembly of small peptides on monolayer protected gold nanoparticles has been studied as a means to develop dynamic nanoproteins for application in biomolecular recognition and catalysis. The first part has been dedicated to the identification and optimization of small peptides able to bind with high affinity to the surface of Au NP 1, which are gold nanoparticles (d ∼ 2 nm) covered with a monolayer of C9-thiols containing a 1,4,7-triazacyclonane•Zn(II) head group. The results showed four potential candidates of which the tripeptide LWS(p) (S(p) = phosphoserine) had the highest affinity. From a series of studies in which the metal-ion in the monolayer was varied, it emerged that Zn(II) gave the best results. Using LWS(p) as a lead structure a small peptide library was synthesized successively in which additional amino acid residues were attached to the binding unit. Amino acids containing negatively or positively charged, polar and apolar side chains were chosen in order to create a chemical diverse library. Subsequent binding studies showed that all peptides had a very high affinity for Au NP 1, apart from the peptides containing positively charged amino acids. Subsequently, the peptide library was used to self-assembly a dynamic nanoprotein by adding all peptides simultaneously to Au NP 1. Binding studies revealed that binding occurred under saturation conditions at low micromolar concentrations in aqueous buffer at pH = 7. The addition of a competitor for binding resulted in a complete displacement of the peptides demonstrating the dynamic nature of the surface. In this way it has been demonstrated that it is possible to build up a complex multivalent system in a straightforward manner. The dynamic nature of the system was exploited in a series of self-selection experiments, aimed at determining how the surface composition on Au NP 1 would change when an excess of peptides would be present. A new protocol relying on the use of ultracentrifugation filters containing a MW cut-off membrane was developed for the purpose of analyzing the surface composition. The results showed a spontaneous self-selection of the peptides with a higher affinity for Au NP 1 upon increasing the overall concentration of the peptide library. In the next stage, the ability of the nanoprotein to interact with natural protein surfaces was investigated. A particular attention was paid to exploitation of the dynamic nature of the assembly. The serine protease chymotrypsin (ChT) was chosen as a target, because previous literature reports had already mentioned that peptide-functionalized Au NPs are able to bind ChT. Binding assays confirmed that the presence of ChT did not affect the interaction between the peptide library and Au NP 1. Apart from peptide P2, none of the peptides was hydrolyzed by ChT. Enzyme activity studies in the presence of Au NP 1-peptide systems did not provide conclusive data. The obtained data showed a slight activation of ChT (1.5 times) in the presence of Au NP, irrespective of whether peptides were present or not. Such an activation of ChT by cationic agents has also been reported in other studies, but a clear explanation is not yet available. Since the measurement of enzyme activity is an indirect method of measuring the interaction between the nanoproteins and ChT, the attention was shifted towards a direct method relying on the ultracentrifugation experiments developed earlier. The aim was to investigate whether the surface composition would be affected by the addition of ChT. Initial data from the ultracentrifugation experiments and additional fluorescence studies seemed to suggest the formation of a ternary multivalent complex with peptide P1 sandwiched between Au NP 1 and ChT. However, further experiments under different conditions and including other techniques (such as ITC and DLS) are required to confirm these results. Finally, a collaboration with the Ulijn group at the University of Strathclyde led to a detailed investigation of the activity of Au NP 1 as artificial phosphatases. The original idea was to exploit the high affinity of peptides for Au NP 1 to shift the equilibrium of a dynamic system of interconverting peptides (catalyzed by thermolysin). However, initial studies immediately revealed that after some days the nanoparticles-enzyme mixture caused the dephosphorylation of Fmoc-Yp-OH. This observation led to an in depth study of the origin of this reaction. Initial experiments performed at high concentrations pointed to thermolysin as the prime responsible for the dephosphorylation reaction assisted by Zn(II) or Au NP 1. Under these conditions hardly any activity by Au NP 1 was observed. However, the picture changed completely when the kinetic studies were repeated at much lower (micro)molar concentrations. Now, a strong catalytic activity of Au NP 1 was detected. Indeed, at conditions, i.e. Fmoc-Yp-OH closer to the SSC of Au NP 1, only 10 hours were needed to convert 50% of substrate. Although for a precise understanding of the mechanism more studies are required, the fact that Au NP 1 is able to cause the dephosphorylation of a monophosphate is a very exciting result, considering that the catalytic activity of Au NP 1 and related systems has so far mainly been limited to activated phosphodiesters.

Le interazioni proteina-proteina controllano un gran numero di vie regolatorie all'interno dell'organismo e giocano un ruolo chiave in molte patologie. Il riconoscimento della superficie di una proteina permette di ottenere un potente strumento per la regolazione di queste interazioni. Le nanoparticelle d'oro sono un’adeguata piattaforma per la multi-funzionalizzazione con un'ampia gamma di leganti biologici per l'interazione selettiva e la rivelazione di target biologici come proteine. In particolare le nanoparticelle d'oro funzionalizzate con frammenti peptidici sono molto interessanti per questo scopo, dal momento in cui i peptidi contengono tutte le informazioni chimiche necessarie per interagire con le proteine presenti in natura. In passato l'auto assemblaggio, la spontanea organizzazione di molecole in aggregati ordinati, è emersa come una via molto promettente per lo sviluppo di sistemi altamente complessi di dimensione nanometrica. AuNPs funzionalizzate con tioli che presentano 1,4,7 triazaciclononano (TACN)Zn(II) come gruppi di testa possono essere utilizzate come validi sistemi per la formazione di strutture supramolecolari multivalenti. In questo PhD l'auto-assemblaggio di piccoli peptidi su nanoparticelle d’oro protette da un monostrato costituito da tioli è stato studiato come mezzo per sviluppare nanoproteine dinamiche per applicazioni come il riconoscimento biomolecolare e la catalisi. La prima parte è stata dedicata all’identificazione e ottimizzazione di piccoli peptidi capaci di legarsi con alta affinità alla superficie delle Au NP 1, che sono nanoparticelle d’oro (d ~ 2 nm) ricoperte da un monostrato di tioli costituiti da una catena alchilica con nove carboni e 1,4,7-triazaciclononano • Zn(II) come gruppo di testa. I risultati hanno mostrato quattro potenziali candidati di cui il tripeptide LWS (p) (S (p) = fosfoserina) presenta la più alta affinità. Da una serie di studi in cui è stato variato il metallo-ione coordinato al 1,4,7-triazaciclononano nel monostrato, lo Zn(II) ha dato i migliori risultati. Utilizzando LWS (p) come struttura principale, una piccola libreria di peptidi è stata sintetizzata in cui ulteriori residui amminoacidici sono stati attaccati all'unità vincolante. Gli amminoacidi contenenti cariche negative o positive, catene laterali polari o apolari sono stati scelti in modo di creare una libreria chimica con ampia diversità. Successivi studi di interazione hanno mostrato che tutti i peptidi avevano un'affinità molto elevata per le Au NP 1, tranne i peptidi contenenti amminoacidi carichi positivamente. Successivamente, aggiungendo tutti i peptidi contemporaneamente sulle Au NP 1, si è cercato di promuovere l’autoassemblaggio di una nano-proteina dinamica. Studi di affinità hanno rivelato che l’interazione avviene in condizioni di saturazione a concentrazioni in scala micromolare (tampone acquoso, pH = 7). L'aggiunta di un composto che compete con i peptidi per la superficie delle Au NP 1 provoca uno spiazzamento completo dei peptidi mostrando la natura dinamica della superficie. In questo modo è stato dimostrato che è possibile costruire in modo semplice un sistema multivalente complesso. La natura dinamica del sistema è stata sfruttata in una serie di esperimenti di auto-selezione, volti a determinare come la composizione della superficie peptidica sulle Au NP 1 cambi dopo l’aggiunta di un eccesso di peptidi. È stato sviluppato un nuovo protocollo basato sull'impiego di filtri da ultracentrifugazione contenenti una membrana con un determinato limite di PM allo scopo di analizzare la composizione dei peptidi sulla superficie. I risultati hanno mostrato una spontanea selezione dei peptidi con una maggiore affinità per Au NP 1 all'aumentare della concentrazione complessiva della libreria peptidica. Nella fase successiva, è stata studiata la capacità delle nano-proteine di interagire con superfici proteiche naturali. La chimotripsina serina proteasi (ChT) è stata scelta come target. Era già riportato in letteratura, infatti, che le Au NP funzionalizzate con peptidi sono in grado di interagire con la ChT. Esperimenti di binding hanno confermato che la presenza della proteina non influenza l'interazione tra la libreria peptidica e le Au NP 1. Nessuno dei peptidi è stato idrolizzato dalla ChT, a parte il peptide P2. Gli studi sull'attività enzimatica in presenza di Au NP 1-peptide non hanno fornito dati conclusivi. I dati ottenuti hanno mostrato una lieve attivazione della ChT (1.5 volte) in presenza di Au NP, indipendentemente dalla presenza dei peptidi. Una tale attivazione della ChT dovuta agenti cationici è stata riportata anche in altri studi, ma una spiegazione chiara non è ancora disponibile. L'attenzione, quindi, si è spostata verso un metodo diretto per misurare l'interazione tra i nano-proteine e ChT basandosi sugli esperimenti di ultracentrifugazione sviluppati in precedenza, considerando che la misurazione dell'attività enzimatica è un metodo indiretto. L'obiettivo era quello di verificare se la composizione della superficie risentisse dell'aggiunta della proteina. I dati iniziali degli esperimenti di ultracentrifugazione e studi di fluorescenza supplementari sembravano suggerire la formazione di un complesso ternario multivalente tra le Au NP 1 e la ChT e il peptide P1. Tuttavia, ulteriori esperimenti con diverse condizioni sperimentali e l’utilizzo di altre tecniche di analisi (come la ITC e DLS) sono necessari per confermare questi risultati. Infine, una collaborazione con il Prof. Ulijn presso l'Università di Strathclyde ha portato ad un esame approfondito dell’attività fosfatasi delle Au NP 1. L'idea originale era quella di sfruttare l'alta affinità dei peptidi per Au NP 1 per spostare l'equilibrio di un sistema dinamico di inter-conversione degli stessi (catalizzata dalla termolisina). Tuttavia, gli studi iniziali hanno rivelato che, dopo alcuni giorni, la miscela composta da nanoparticelle ed enzima ha causato la defosforilazione dell’ Fmoc-Yp-OH. Questa osservazione ha portato ad uno studio più approfondito sull'origine di questa reazione. I primi esperimenti effettuati ad alte concentrazioni hanno indicato che la termolisina assistita dallo Zn(II) o dalle Au NP 1 è la prima responsabile della reazione di defosforilazione. In queste condizioni non è stata osservata nessuna attività da parte delle Au NP 1. Il quadro è cambiato completamente nel momento in cui gli studi cinetici sono stati ripetuti a più basse concentrazioni (micromolare). È stato rilevata una forte attività catalitica dalle Au NP 1. In condizioni in cui la concentrazione dell’Fmoc-Yp-OH è vicina alla SSC sulle Au NP 1, sono state necessarie soltanto 10 ore per convertire il 50% del substrato. Tuttavia, per una precisa comprensione del meccanismo sono necessari ulteriori studi, il fatto che le Au NP 1 siano in grado di provocare la defosforilazione di un monofosfato è un risultato molto interessante, considerando che l'attività catalitica delle Au NP 1 e sistemi relativi sono limitati, finora, principalmente a fosfodiesteri attivati.

Dynamic Nanoproteins: Self-Assembly of Peptides on Monolayer Protected Gold Nanoparticles / Garcia Martin, Sergio. - (2015 Jul 31).

Dynamic Nanoproteins: Self-Assembly of Peptides on Monolayer Protected Gold Nanoparticles

Garcia Martin, Sergio
2015

Abstract

Le interazioni proteina-proteina controllano un gran numero di vie regolatorie all'interno dell'organismo e giocano un ruolo chiave in molte patologie. Il riconoscimento della superficie di una proteina permette di ottenere un potente strumento per la regolazione di queste interazioni. Le nanoparticelle d'oro sono un’adeguata piattaforma per la multi-funzionalizzazione con un'ampia gamma di leganti biologici per l'interazione selettiva e la rivelazione di target biologici come proteine. In particolare le nanoparticelle d'oro funzionalizzate con frammenti peptidici sono molto interessanti per questo scopo, dal momento in cui i peptidi contengono tutte le informazioni chimiche necessarie per interagire con le proteine presenti in natura. In passato l'auto assemblaggio, la spontanea organizzazione di molecole in aggregati ordinati, è emersa come una via molto promettente per lo sviluppo di sistemi altamente complessi di dimensione nanometrica. AuNPs funzionalizzate con tioli che presentano 1,4,7 triazaciclononano (TACN)Zn(II) come gruppi di testa possono essere utilizzate come validi sistemi per la formazione di strutture supramolecolari multivalenti. In questo PhD l'auto-assemblaggio di piccoli peptidi su nanoparticelle d’oro protette da un monostrato costituito da tioli è stato studiato come mezzo per sviluppare nanoproteine dinamiche per applicazioni come il riconoscimento biomolecolare e la catalisi. La prima parte è stata dedicata all’identificazione e ottimizzazione di piccoli peptidi capaci di legarsi con alta affinità alla superficie delle Au NP 1, che sono nanoparticelle d’oro (d ~ 2 nm) ricoperte da un monostrato di tioli costituiti da una catena alchilica con nove carboni e 1,4,7-triazaciclononano • Zn(II) come gruppo di testa. I risultati hanno mostrato quattro potenziali candidati di cui il tripeptide LWS (p) (S (p) = fosfoserina) presenta la più alta affinità. Da una serie di studi in cui è stato variato il metallo-ione coordinato al 1,4,7-triazaciclononano nel monostrato, lo Zn(II) ha dato i migliori risultati. Utilizzando LWS (p) come struttura principale, una piccola libreria di peptidi è stata sintetizzata in cui ulteriori residui amminoacidici sono stati attaccati all'unità vincolante. Gli amminoacidi contenenti cariche negative o positive, catene laterali polari o apolari sono stati scelti in modo di creare una libreria chimica con ampia diversità. Successivi studi di interazione hanno mostrato che tutti i peptidi avevano un'affinità molto elevata per le Au NP 1, tranne i peptidi contenenti amminoacidi carichi positivamente. Successivamente, aggiungendo tutti i peptidi contemporaneamente sulle Au NP 1, si è cercato di promuovere l’autoassemblaggio di una nano-proteina dinamica. Studi di affinità hanno rivelato che l’interazione avviene in condizioni di saturazione a concentrazioni in scala micromolare (tampone acquoso, pH = 7). L'aggiunta di un composto che compete con i peptidi per la superficie delle Au NP 1 provoca uno spiazzamento completo dei peptidi mostrando la natura dinamica della superficie. In questo modo è stato dimostrato che è possibile costruire in modo semplice un sistema multivalente complesso. La natura dinamica del sistema è stata sfruttata in una serie di esperimenti di auto-selezione, volti a determinare come la composizione della superficie peptidica sulle Au NP 1 cambi dopo l’aggiunta di un eccesso di peptidi. È stato sviluppato un nuovo protocollo basato sull'impiego di filtri da ultracentrifugazione contenenti una membrana con un determinato limite di PM allo scopo di analizzare la composizione dei peptidi sulla superficie. I risultati hanno mostrato una spontanea selezione dei peptidi con una maggiore affinità per Au NP 1 all'aumentare della concentrazione complessiva della libreria peptidica. Nella fase successiva, è stata studiata la capacità delle nano-proteine di interagire con superfici proteiche naturali. La chimotripsina serina proteasi (ChT) è stata scelta come target. Era già riportato in letteratura, infatti, che le Au NP funzionalizzate con peptidi sono in grado di interagire con la ChT. Esperimenti di binding hanno confermato che la presenza della proteina non influenza l'interazione tra la libreria peptidica e le Au NP 1. Nessuno dei peptidi è stato idrolizzato dalla ChT, a parte il peptide P2. Gli studi sull'attività enzimatica in presenza di Au NP 1-peptide non hanno fornito dati conclusivi. I dati ottenuti hanno mostrato una lieve attivazione della ChT (1.5 volte) in presenza di Au NP, indipendentemente dalla presenza dei peptidi. Una tale attivazione della ChT dovuta agenti cationici è stata riportata anche in altri studi, ma una spiegazione chiara non è ancora disponibile. L'attenzione, quindi, si è spostata verso un metodo diretto per misurare l'interazione tra i nano-proteine e ChT basandosi sugli esperimenti di ultracentrifugazione sviluppati in precedenza, considerando che la misurazione dell'attività enzimatica è un metodo indiretto. L'obiettivo era quello di verificare se la composizione della superficie risentisse dell'aggiunta della proteina. I dati iniziali degli esperimenti di ultracentrifugazione e studi di fluorescenza supplementari sembravano suggerire la formazione di un complesso ternario multivalente tra le Au NP 1 e la ChT e il peptide P1. Tuttavia, ulteriori esperimenti con diverse condizioni sperimentali e l’utilizzo di altre tecniche di analisi (come la ITC e DLS) sono necessari per confermare questi risultati. Infine, una collaborazione con il Prof. Ulijn presso l'Università di Strathclyde ha portato ad un esame approfondito dell’attività fosfatasi delle Au NP 1. L'idea originale era quella di sfruttare l'alta affinità dei peptidi per Au NP 1 per spostare l'equilibrio di un sistema dinamico di inter-conversione degli stessi (catalizzata dalla termolisina). Tuttavia, gli studi iniziali hanno rivelato che, dopo alcuni giorni, la miscela composta da nanoparticelle ed enzima ha causato la defosforilazione dell’ Fmoc-Yp-OH. Questa osservazione ha portato ad uno studio più approfondito sull'origine di questa reazione. I primi esperimenti effettuati ad alte concentrazioni hanno indicato che la termolisina assistita dallo Zn(II) o dalle Au NP 1 è la prima responsabile della reazione di defosforilazione. In queste condizioni non è stata osservata nessuna attività da parte delle Au NP 1. Il quadro è cambiato completamente nel momento in cui gli studi cinetici sono stati ripetuti a più basse concentrazioni (micromolare). È stato rilevata una forte attività catalitica dalle Au NP 1. In condizioni in cui la concentrazione dell’Fmoc-Yp-OH è vicina alla SSC sulle Au NP 1, sono state necessarie soltanto 10 ore per convertire il 50% del substrato. Tuttavia, per una precisa comprensione del meccanismo sono necessari ulteriori studi, il fatto che le Au NP 1 siano in grado di provocare la defosforilazione di un monofosfato è un risultato molto interessante, considerando che l'attività catalitica delle Au NP 1 e sistemi relativi sono limitati, finora, principalmente a fosfodiesteri attivati.
31-lug-2015
Protein-protein interactions mediate a large number of important regulatory pathways in the organism and also play a central role in many pathologies. Protein surface recognition provides a powerful tool for the regulation of those protein-protein interactions. Gold nanoparticles offer a suitable platform for multi-functionalization with a wide range of biological ligands for the selective binding and detection of biological targets such as proteins. In particular, gold nanoparticles functionalized with peptide fragments are very attractive for that purpose, since peptides contain all necessary chemical information to interact with natural proteins. During the past years, self-assembly, i.e. the spontaneous organization of molecules into ordered aggregates, has emerged as the most attractive way to develop highly complex nanosized systems. Au NPs containing 1,4,7-triazacyclononane (TACN)·Zn(II) head groups (Au NP 1) have been shown to be attractive scaffolds for the formation of multivalent supramolecular structures. In this PhD-project the self-assembly of small peptides on monolayer protected gold nanoparticles has been studied as a means to develop dynamic nanoproteins for application in biomolecular recognition and catalysis. The first part has been dedicated to the identification and optimization of small peptides able to bind with high affinity to the surface of Au NP 1, which are gold nanoparticles (d ∼ 2 nm) covered with a monolayer of C9-thiols containing a 1,4,7-triazacyclonane•Zn(II) head group. The results showed four potential candidates of which the tripeptide LWS(p) (S(p) = phosphoserine) had the highest affinity. From a series of studies in which the metal-ion in the monolayer was varied, it emerged that Zn(II) gave the best results. Using LWS(p) as a lead structure a small peptide library was synthesized successively in which additional amino acid residues were attached to the binding unit. Amino acids containing negatively or positively charged, polar and apolar side chains were chosen in order to create a chemical diverse library. Subsequent binding studies showed that all peptides had a very high affinity for Au NP 1, apart from the peptides containing positively charged amino acids. Subsequently, the peptide library was used to self-assembly a dynamic nanoprotein by adding all peptides simultaneously to Au NP 1. Binding studies revealed that binding occurred under saturation conditions at low micromolar concentrations in aqueous buffer at pH = 7. The addition of a competitor for binding resulted in a complete displacement of the peptides demonstrating the dynamic nature of the surface. In this way it has been demonstrated that it is possible to build up a complex multivalent system in a straightforward manner. The dynamic nature of the system was exploited in a series of self-selection experiments, aimed at determining how the surface composition on Au NP 1 would change when an excess of peptides would be present. A new protocol relying on the use of ultracentrifugation filters containing a MW cut-off membrane was developed for the purpose of analyzing the surface composition. The results showed a spontaneous self-selection of the peptides with a higher affinity for Au NP 1 upon increasing the overall concentration of the peptide library. In the next stage, the ability of the nanoprotein to interact with natural protein surfaces was investigated. A particular attention was paid to exploitation of the dynamic nature of the assembly. The serine protease chymotrypsin (ChT) was chosen as a target, because previous literature reports had already mentioned that peptide-functionalized Au NPs are able to bind ChT. Binding assays confirmed that the presence of ChT did not affect the interaction between the peptide library and Au NP 1. Apart from peptide P2, none of the peptides was hydrolyzed by ChT. Enzyme activity studies in the presence of Au NP 1-peptide systems did not provide conclusive data. The obtained data showed a slight activation of ChT (1.5 times) in the presence of Au NP, irrespective of whether peptides were present or not. Such an activation of ChT by cationic agents has also been reported in other studies, but a clear explanation is not yet available. Since the measurement of enzyme activity is an indirect method of measuring the interaction between the nanoproteins and ChT, the attention was shifted towards a direct method relying on the ultracentrifugation experiments developed earlier. The aim was to investigate whether the surface composition would be affected by the addition of ChT. Initial data from the ultracentrifugation experiments and additional fluorescence studies seemed to suggest the formation of a ternary multivalent complex with peptide P1 sandwiched between Au NP 1 and ChT. However, further experiments under different conditions and including other techniques (such as ITC and DLS) are required to confirm these results. Finally, a collaboration with the Ulijn group at the University of Strathclyde led to a detailed investigation of the activity of Au NP 1 as artificial phosphatases. The original idea was to exploit the high affinity of peptides for Au NP 1 to shift the equilibrium of a dynamic system of interconverting peptides (catalyzed by thermolysin). However, initial studies immediately revealed that after some days the nanoparticles-enzyme mixture caused the dephosphorylation of Fmoc-Yp-OH. This observation led to an in depth study of the origin of this reaction. Initial experiments performed at high concentrations pointed to thermolysin as the prime responsible for the dephosphorylation reaction assisted by Zn(II) or Au NP 1. Under these conditions hardly any activity by Au NP 1 was observed. However, the picture changed completely when the kinetic studies were repeated at much lower (micro)molar concentrations. Now, a strong catalytic activity of Au NP 1 was detected. Indeed, at conditions, i.e. Fmoc-Yp-OH closer to the SSC of Au NP 1, only 10 hours were needed to convert 50% of substrate. Although for a precise understanding of the mechanism more studies are required, the fact that Au NP 1 is able to cause the dephosphorylation of a monophosphate is a very exciting result, considering that the catalytic activity of Au NP 1 and related systems has so far mainly been limited to activated phosphodiesters.
gold nanoparticles, nanoprotein, peptides, self-assembly, dynamic, catalysis, phosphatase
Dynamic Nanoproteins: Self-Assembly of Peptides on Monolayer Protected Gold Nanoparticles / Garcia Martin, Sergio. - (2015 Jul 31).
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