Vai ai contenuti. | Spostati sulla navigazione | Spostati sulla ricerca | Vai al menu | Contatti | Accessibilità

| Crea un account

Bisio, Valeria (2016) Pediatric AML: from prognostic biomarkers to functional characterization. [Tesi di dottorato]

Full text disponibile come:

[img]Documento PDF (tesi di dottorato) - Versione sottomessa
Tesi non accessible fino a 01 Febbraio 2019 per motivi correlati alla proprietà intellettuale.
Visibile a: nessuno


Abstract (inglese)

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous disease characterized by recurrent genetic aberrations. The prognosis of childhood AML has significantly improved over the last two decades, nevertheless the 30% of cases still relapse1–3. Intensive efforts have been devoted to identify new genetic abnormalities and altered signalling pathways to better stratify patients in different risk classes in order to improve children survival treating them with a more specific therapy. However still half of the AML cases do not present a recurrent genetic aberration. Thus, during this PhD I focused on the identification of new molecular markers at diagnosis and the evaluation of known markers during the disease follow up. The prognostic value of these markers has been evaluated to improve patients stratification and whenever possible to suggest novel tailored treatments. The overall goal of this study was also to functionally dissect the leukemogenic mechanism of action of these new molecular markers, in order to find suitable candidate gene/pathway to be targeted in novel personalized therapies.
Initially, a screening of new markers at diagnosis was performed in a large Italian cohort of pediatric AML defining the incidence of genetic abnormalities previously described as single case reports or as novel rearrangements identified by next-generation sequencing. The del(4)(q12)FIP1L1-PDGFRA, t(16;21)(p11;q22)FUS-ERG, t(8;16)(p11;p13)MOZ-CB, t(11;17)(q23;q12-21)MLL-AF17, t(4;11)(q35;q23)MLL-ARGB2, t(3;5)(q25;q34)NPM1-MLF1, MLLPTD, and t(11;17)(p15.5;p13)NUP98-PHF23 were finally classified to be rare events at diagnosis. An exception was the translocation t(5;11)(q35;p15.5)NUP98-NSD1 which reached an incidence of 4% and was found to occur together with FLT3-ITD mutation in more than 50% of cases.
Then, the mutations of the oncogene c-KIT were taken into evaluation in a selected subset of CBF-rearranged patients since these abnormalities were previously reported to be frequent in adults with CFB-AML at diagnosis4. I defined a high frequency of c-KIT mutations for RUNX1-RUNX1T1 (25%) and for CBFB-MYH11 (18.5%) rearranged pediatric patients. Prognostic value of c-KIT mutations was determined only for the RUNX1-RUNX1T1 rearranged patients, suggesting that they could be further evaluated for a targeted therapy with tyrosine kinase inhibitors.
Then, I take into consideration the evaluation of a molecular marker detected at diagnosis during therapy course, by evaluating the role of monitoring the minimal residual disease (MRD) by Real time RQ-PCR . In pediatric AML, post-treatment MRD monitoring of biomarkers has been rarely used in the clinical management of patients:. molecular markers suitable for MRD detection still remains debated. I improved knowledge for patients with AML1-ETO rearrangement and in FLT3-ITD mutation, revealing that MRD levels after induction chemotherapy were prognostically significant in identifying those with higher risk to relapse and die These new group of patients , within the same genetic subgroup, may benefit of novel risk stratification or pre-emptive therapy strategies supporting the t(8;21) and FLT3-ITD as reliable molecular markers for disease monitoring also during follow up.
A large part of this PhD program was committed to dissect the biology of some recurrent aberrancies being their functional role investigation mandatory to develop new targeted therapies to improve children cure. I hypothesized that biology might explain the difference in therapy response highlighted in the MRD study performed on FLT3-ITDpatientswhere half of them was found to reduce MRD levels less than 2 logs from diagnosis with a consequent high risk of relapse and death. By gene expression analyses , I showed that these patients had a different gene expression profile related to epigenetic control, most concerning methylation and acetylation of histones. These findings may suggest that the use of epigenetic drugs, combined with conventional strategies, could be a new therapeutic opportunity for a the FLT3-ITD patients showing high MRD levels after the end of first induction course.
A second functional study was carried on the t(6;11)(q27;q23)MLL-AF6 rearrangement. In the Italian AML cohort, 10% of AML patients are MLL-rearranged5 and among them the t(6;11) cases present the worst prognosis5,6. By in vitro studies, I found that wild type AF6 protein co-localized with RAS in the bone marrow of healthy donors, while AF6 was sequestered into the nucleus provoking RAS overactivation in t(6;11)(q27;q23) rearranged AML. The role of AF6 in RAS inhibition was confirmed by AF6 silencing or treatment with RAS antagonists, revealing the implication of RAS pathway in the aggressiveness of MLL-AF6 leukemia. This discovery confirmed the usefulness of Tipifarnib, a drug currently used in RASopathies7, in this AML subgroup, and opens for new targeted therapies to overcome their poor outcome.
The third functional study was performed on a gene recently found implicated in several translocations being not rare (4.6%) in pediatric AML at diagnosis and with outcome severe prognosis, NUP988–10. I deep inside the biology of all the NUP98 detected rearrangements, and identified a specific gene expression pattern as well as a typical outcome. Gene ontology revealed an enrichment in biological processes linked to the nuclear organization and chromosome instability, confirmed also by in vitro studies on NUP98-NSD1 rearranged primary cells. Moreover, I reported CREB control in the transcription of NUP98 and consequently of its chimeras. Altogether, these findings open for further studies into the leukemogenic mechanism of NUP98-rearranged AML, and highlight CREB as a possible therapeutic target to decrease the oncogenic properties of NUP98-chimeras.
Finally, during this PhD a variety of molecular lesions were identified permitting a more detailed diagnosis for pediatric AML. The prognostic significance of each marker was evaluated and included in the risk classes stratification of the new AIEOP LAM 2013 protocol, conferring to genetics a strong role in guiding therapeutic strategies. Functional studies were able to characterize new candidate genes that can be specific for a subgroups of AML patients with detrimental prognosis, to be further studied for their therapeutic role and when possible for a even more personalized therapy. All together, this work achieved results that are currently translated into clinical management, and will contribute to the improvement of the outcome of AML children.

Abstract (italiano)

La leucemia acuta mieloide (LAM) è una malattia geneticamente eterogenea,caratterizzata da ricorrenti anomalie molecolari. Nonostante la prognosi dei pazienti pediatrici affetti da LAM sia notevolmente migliorata negli ultimi anni, il tasso di ripresa di malattia è di circa il 30% 1–3. Numerosi studi sono emersi per identificare nuove anomalie genetiche o vie di segnale deregolate nella LAM pediatrica al fine di migliorare la stratificazione dei pazienti nelle diverse classi di rischio, e di conseguenza poter adottare dei percorsi terapeutici specifici e più mirati. Ad oggi tuttavia, per circa il 50% dei casi non si trova alla diagnosi un marcatore molecolare noto in grado di garantire una corretta stratificazione del paziente. Per tale ragione il mio dottorato di ricerca ha avuto come primo scopo la ricerca e l’identificazione di nuovi marcatori molecolari alla diagnosi , e di studiarne il ruolo prognostico affinché si possa garantire una più corretta diagnosi a un più alto numero di pazienti, e si possa valutarne in caso un ruolo anche come marker di monitoraggi durante la terapia del paziente. Infine, allo scopo puramente diagnostico, è stato abbinato uno scopo di ricerca di base, cioè caratterizzare il processo neoplastico mediato da alcuni di questi marcatori molecolari, cercando di identificare dei geni malattia che possano servire essere dei candidati target terapeutici, utili a porre le basi per una gestione sempre più personalizzata e quindi efficace della terapia.
Inizialmente ho effettuato una serie di screening molecolari con l’intento di valutare l'incidenza di alcune anomalie genetiche precedentemente conosciute solo tramite case report o identificate tramite sequenziamento massivo dell’RNA. In particolare, ho definito la del(4)(q12)FIP1L1-PDGFRA, la t(16;21)(p11;q22)FUS-ERG, la t(8;16)(p11;p13)MOZ-CBP, la t(11;17)(q23;q12-21)MLL-AF17, t(4;11)(q35;q23)MLL-ARGB2, la t(3;5)(q25;q34)NPM1-MLF1, il MLLPTD, e la t(11;17)(p15.5;p13)NUP98-PHF23 come eventi mutazionali rari nella coorte pediatrica italiana arruolata nel protocollo LAM 2001-02 (totale pazienti N=482). Al contrario, la t(5;11)(q35;p15.5)NUP98-NSD1 è stata riscontrata avvenire con una frequenza del 4%, e spesso in concomitanza alla mutazione FLT3-ITD (nel 50% dei casi). Tale traslocazione è stata inoltre valutata per il suo peso prognostico, rivelandosi un fattore prognostico negativo perché associato ad un elevato rischio di recidiva e morte.
Poi, un altro screening ha riguardato la valutazione delle presenza di mutazioni a carico del gene c-KIT, in un gruppo di pazienti già con riarrangiamento del CBF. Le mutazioni di questo recettore delle tirosin chinasi sono già state ampiamente descritte in numerosi studi soprattutto riguardanti pazienti adulti affetti da LAM4. I risultati confermano un’alta frequenza di mutazione di c-KIT anche nei pazienti pediatrici con t(8;21)RUNX1-RUNX1T1 (25%) e con inv(16)CBFB-MYH11 ( 18.5%). Il valore prognostico negativo è risultato significativo solo nel gruppo con RUNX1-RUNX1T1, per i quali, l’identificazione di queste mutazioni potrebbero supportare l’uso di eventuali terapie con inibitori delle tirosin chinasi per migliorare la loro cura.
Oltre alla diagnosi, il marcatore molecolare può avere un ruolo fondamentale anche durante il corso della malattia. Mi sono occupata di mettere a punto lo studio della malattia residua minima (MRM) mediante PCR quantitativa per tre importanti marker ricorrenti nelle LAM pediatriche. Ad oggi, il monitoraggio della MRM nella LAM pediatrica è scarsamente utilizzato. Qui, si propone il monitoraggio della MRM tramite la RQ-PCR dopo chemioterapia di induzione nei pazienti con t(8;21) e FLT3-ITD in grado di individuare i pazienti a più alto rischio di recidivare. Aver identificato la t(8;21) e FLT3-ITD come buoni marcatori molecolari per il monitoraggi della MRM, consentirà ai clinici di poter valutare delle strategie alternative in quei pazienti che potrebbero beneficiare di terapie farmacologiche supplementari al fine di evitare la ripresa della malattia.
Infine, molto tempo del mio dottorato è stato impegnato alla caratterizzazione biologica e funzionale di alcuni marcatori molecolari ricorrenti con il fine ultimo di identificare nuovi possibili target terapeutici per migliorare la cure e la sopravvivenza dei pazienti. In primis, ipotizzando che la diversa risposta terapeutica dei casi FLT3-ITD abbia origine da una diversità biologia, abbiamo effettuato delle analisi di espressione genica su questo gruppo di pazienti. Questo studio ha permesso di identificare un profilo di espressione genica caratteristico per i pazienti che riducendo meno la malattia dopo l’induzione vanno incontro a un più alto rischio di ricadere. I processi biologici arricchiti in questi pazienti sono risultati riguardare la metilazione e l’acetilazione degli istoni, suggerendo che eventuali agenti deacentilanti o demetilanti, in combinazione con la terapia convenzionale, possano migliorare la sopravvivenza libera da avventi avversi di questi pazienti.
Un altro studio funzionale ha preso in esame la t(6;11)(q27;q23)MLL-AF6. Circa il 10% della popolazione pediatrica italiana presenta uno dei riarrangiamenti a carico del gene MLL , tra questi la t(6;11) presenta la prognosi peggiore5,6. Attraverso studi in vitro, ho rivelato che la proteina AF6 endogena si localizza nel citoplasma insieme all’oncogene RAS in cellule di midollo osseo sano. Viceversa, nei pazienti con traslocazione t(6;11), AF6 è stato riscontrato essere nel nucleo impedendo il fisiologico controllo di RAS nel citoplasma, comportandone un’iper-attivazione della via. Sia il silenziamento di AF6 sia il trattamento con inibitori di RAS hanno confermato il ruolo chiave del pathway di RAS nel sostenere l’aggressività di questa leucemia. Infine, lo studio ha comprovato il Tipifarnib, farmaco già in uso nelle RASopatie7, come nuovo farmaco utilizzabile nei pazienti pediatrici con t(6;11).
Il terzo studio funzionale ha riguardato un gene molto nuovo nella LAM pediatrica, il gene NUP98. Le traslocazioni somatiche associate a questo gene8–10 si sono riscontrate non rare nella corte pediatrica LAM italiana (4.6%). Lo studio più funzionale ha poi chiarito che ciascuna di queste traslocazioni identificate una diversa biologia così come un diverso ruolo prognostico . Grazie all’analisi di espressione genica ho identificato l’instabilità genetica come il processo biologico maggiormente deregolato in questo gruppo di pazienti con NUP98-LAM. Tale processo è stato verificato in vitro grazie a colture cellulari primarie di pazienti NUP98-NSD1 riarrangiati. Inoltre, ho dimostrato che il fattore di trascrizione CREB controlla la trascrizione del gene NUP98, cosi come di tutte le oncoproteine che si riscontrano nelle LAM mantenere l’N terminale dello stesso. Questi risultati identificano il ruolo funzionale della chimera NUP98-NSD1, e candidano CREB a possibile bersaglio terapeutico per combattere l’espressione della chimera e quindi la progressione della malattia .
In conclusione, durante i tre anni di dottorato di ricerca ho caratterizzato una serie di marcatori molecolari che hanno permesso una migliore e più dettagliata stratificazione dei pazienti alla diagnosi. Dato il valore prognostico dei vari marcatori, essi sono stati inclusi nel nuovo protocollo terapeutico LAM 2013, che conferisce alla genetica molecolare un ruolo determinante nel guidare la terapia. Infine gli studi funzionali hanno finora portato all‘identificazione di nuovi target specifici in vari sottogruppi di LAM a prognosi infausta. Studi futuri sono in corso per valutare questi biomarcatori come target terapeutici da utilizzare per incrementare le possibilità di curare i bambini affetti da LAM .

Aggiungi a RefWorks
Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Basso, Giuseppe
Data di deposito della tesi:28 Gennaio 2016
Anno di Pubblicazione:28 Gennaio 2016
Parole chiave (italiano / inglese):Leucemia mieloide acuta pediatrica/ pediatric acute myeloid leukemia, marcatori molecolari/molecular marker, NUP98
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/38 Pediatria generale e specialistica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Salute della Donna e del Bambino
Codice ID:9269
Depositato il:24 Ott 2016 14:39
Simple Metadata
Full Metadata
EndNote Format


I riferimenti della bibliografia possono essere cercati con Cerca la citazione di AIRE, copiando il titolo dell'articolo (o del libro) e la rivista (se presente) nei campi appositi di "Cerca la Citazione di AIRE".
Le url contenute in alcuni riferimenti sono raggiungibili cliccando sul link alla fine della citazione (Vai!) e tramite Google (Ricerca con Google). Il risultato dipende dalla formattazione della citazione.

1. Pui C-H, Carroll WL, Meshinchi S, Arceci RJ. Biology, risk stratification, and therapy of pediatric acute leukemias: an update. J. Clin. Oncol. 2011;29(5):551–565. Cerca con Google

2. Zwaan CM, Kolb E a., Reinhardt D, et al. Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia. J. Clin. Oncol. 2015;33(27):2949–62. Cerca con Google

3. Pession A, Masetti R, Rizzari C, et al. Results of the AIEOP AML 2002/01 multicenter prospective trial for the treatment of children with acute myeloid leukemia. Blood. 2013;122(2):170–178. Cerca con Google

4. Paschka P, Marcucci G, Ruppert AS, et al. Adverse prognostic significance of KIT mutations in adult acute myeloid leukemia with inv(16) and t(8;21): a Cancer and Leukemia Group B Study. J. Clin. Oncol. 2006;24(24):3904–11. Cerca con Google

5. Pigazzi M, Masetti R, Bresolin S, et al. MLL partner genes drive distinct gene expression profiles and genomic alterations in pediatric acute myeloid leukemia: an AIEOP study. Leukemia. 2011;25(3):560–563. Cerca con Google

6. Meyer C, Hofmann J, Burmeister T, et al. The MLL recombinome of acute leukemias in 2013. Leukemia. 2013;27(11):2165–76. Cerca con Google

7. Tsimberidou AM, Chandhasin C, Kurzrock R. Farnesyltransferase inhibitors: where are we now? Expert Opin. Investig. Drugs. 2010;19(12):1569–1580. Cerca con Google

8. Hollink IHIM, van den Heuvel-Eibrink MM, Arentsen-Peters STCJM, et al. NUP98/NSD1 characterizes a novel poor prognostic group in acute myeloid leukemia with a distinct HOX gene expression pattern. Blood. 2011;118(13):3645–56. Cerca con Google

9. de Rooij JDE, Hollink IHIM, Arentsen-Peters STCJM, et al. NUP98/JARID1A is a novel recurrent abnormality in pediatric acute megakaryoblastic leukemia with a distinct HOX gene expression pattern. Leukemia. 2013;27(12):2280–8. Cerca con Google

10. Gough SM, Slape CI, Aplan PD. NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: Common themes and new biologic insights. Blood. 2011;118(24):6247–6257. Cerca con Google

Solo per lo Staff dell Archivio: Modifica questo record