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Balzan, Sara (2016) Characterization of a novel brachytic2 (br2) allele in maize. [Tesi di dottorato]

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Tesi non accessible fino a 29 Gennaio 2019 per motivi correlati alla proprietà intellettuale.
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Abstract (inglese)

Starting from the Green Revolution era, cereals have been bred for dwarf or semi-dwarf phenotype for many advantages, such as increased allocation of energy to seed rather than stem, denser growth, increased resistance to storm damages and reduced loss during harvesting.
Many dwarf mutants are characterized by alteration in hormones biosynthesis and signaling, as brassinosteroids (BR) and gibberellins (GA) pathways, while a defect in polar auxin transport (PAT) causes the sorghum mutant dwarf3 (dw3) and the maize brachytic2 (br2) mutations. Many br2 alleles have been isolated in maize. At Purdue University (Indiana USA), allelic tests conducted on the dwarf NC238 inbred line indicated that the NC238 dwarf phenotype is due to a new br2 allele. The isolation of a tall NC238 plant indicated the mutation is due to a transposon insertion that originated the tall revertant plant in a transposition event. Both dw3 and br2 are mutations affecting the gene orthologue of Arabidopsis thaliana ABCB1, which functions in auxin PAT.
Auxin is a key regulator of plant growth: local biosynthesis, degradation and conjugation contribute to the modulation of IAA homeostasis at the cellular level. ABCBs, together with the PIN FORMED, the AUX1/LAX and the PILS auxin transporters, create a directional auxin flux from the site of synthesis - young tissues - to the site of action. Auxin transport, with local biosynthesis and conjugation, allows the establishment of an auxin gradient, and the local auxin maxima regulates many aspects of the embryonic development, stem cell maintenance, shoot architecture, and tropic growth responses, root development and gravitropism. To date, the majority of the studies on auxin PAT have been focused on Arabidopsis, while less is known in other species, such as maize. This thesis focuses on the characterization of br2:NC238 brachytic maize inbred line. In order to better characterize this maize mutant line, both a phenotypic and genotypic analysis of the NC238 dwarf plants were performed. In parallel, the brachytic 2 allele was introgressed in the B73 maize reference inbred line background.
The present thesis is composed of four chapters.The first chapter is an introduction on Maize biology and genetics and auxin synthesis, metabolism and roles. This section comprises the review I wrote when I was visiting scholar at Prof. Johal lab at Purdue University: "The role of auxin transporters in monocot development". The review describes the roles of auxin transporters in monocot development: maize, rice, sorghum and brachypodium, making comparison with Arabidopsis auxin carriers, when possible. Moreover, a section describing the plant transposable elements structure and classification is present.
The second chapter describes the morphological characteristics of NC238 line. It was previously reported alterations in stem vasculature in br2. Other paper described alteration in leaf cell size and leaf angle. Literature lacks a root system characterization. The develop stage when the br2:NC238 phenotype arise was identify. Seedlings' root system, and stem traits on field grown plants at anthesis (University of Padova farm "L.Toniolo") were measured. The internode length, node diameter, number of nodes, tassel branches and ear position along the stem were recorded. Moreover, 1m deep soil coring at the base of the stem were made, in order to study the root system profile. In addition the anatomy of the stem and auxin localization in stem tissues were observed.
The third chapter regards the genetic characterization of the mutation. Genomic clones and transcripts sequences from both br2:NC238 and the revertant plants were amplified and sequenced. A study on the nature of the br2:NC238 insertion was performed through analyses of the sequence and interrogation against genes, repeats and transposons databases. Moreover, expression analyses of auxin transporters encoding genes were performed.
Chapter four describes the genetic and phenotypic characterization of the br2:B73 line obtained by introgression of the br2:NC238 abcb1mutant allele in the B73 reference line.
In conclusion, br2:NC238 short phenotype is due to the shortening and thickness of the lower internodes. The other parts of the plant are normal. Phenotype appeared when plants were 7-leaf-old. br2:NC238 and the revertant plants were indistinguishable in the early stages of development.
The br2:NC238 mutation is caused by a insertion in a intronic region of abcb1 gene. The insertion is characterized by terminal Inverted repeats (TIRs) and Target Site Duplication (TSD) that are also present twice in the revert line. Despite the similarities with many known transposable elements, it was not possible to find the family the br2:NC238 insertion sequence belongs to. The insertion caused alteration in the gene transcription and alteration in the expression analyses of auxin transporters encoding genes at 3- and 7-leaf-old plant stem tissues were observed. Moreover, an increase in T02 Maize GDB predicted splicing form was observed.
The introgression of br2:NC238 abcb1 mutant allele in B73 reference line genome originated a short stature plant, br2 type. The result indicates the abcb1 mutant allele was responsible for the br2:NC238 phenotype and suggests the allele may be used in breeding programs to obtain lines with reduced height.

Abstract (italiano)

A partire dalla "Rivoluzione verde" sono state selezionate varietà di colture a taglia ridotta, ad esempio riso e sorgo. Molti sono i vantaggi derivanti: un maggior utilizzo di energia per la produzione della granella rispetto alla crescita vegetativa, la possibilità di aumentare la densità delle piante per superficie, la maggior resistenza ai danni da vento e la minor perdita di granella durante raccolta e trasporto.
Molte linee mutanti nane sono caratterizzate da difetti in sintesi, metabolismo o trasporto di ormoni: brassinosteroidi e gibberelline soprattutto. Un difetto nel trasporto di auxina caratterizza le linee mutanti di mais br2 e di sorgo dw3.
Test di allellismo condotti all'Università di Purdue (IN) incrociando la linea di mais NC238 a statura ridotta con altre piante a statura ridotta indicarono che la linea NC238 è un mutante di tipo brachytic 2.
Nel 2003 è stato clonato il gene br2/pgp1/abcb1 responsabile del fenotipo a bassa statura dovuto alla riduzione della lunghezza degli internodi vicini alla base del fusto. Il gene abcb1 codifica per la proteina ABCB1 che appartiene alla famiglia di trasportatori MDR (Multidrug Resistant), sottofamiglia B. Questa proteina è l'omologo della proteina trasportatrice di auxina di Arabidopsis ABCB1.
L'ormone auxina svolge molti ruoli nella regolazione dello sviluppo della pianta, sintesi, degradazione e coniugazione contribuiscono a modulare i livelli di auxina. Le proteine ABCB, assieme a PIN, PILS e AUX/LAX creano una flusso direzionale di auxina dai siti di sintesi (aree meristematiche, giovani tessuti) alle zone dove è necessaria. L'auxina svolge ruoli nello sviluppo embrionale, mantenimento delle cellule indifferenziate, architettura del fusto, risposta tropica, sviluppo e tropismo delle radici. La maggior parte di queste funzioni sono state studiate in Arabidopsis.
Questa tesi si focalizza sull'analisi fenotipica e morfologica della linea br2:NC2382. Una pianta alta era stata isolata in una popolazione di NC238. La mutazione infatti è dovuta a un'inserzione di un trasposone e a seguito di un fenomeno di reversione, in cui il trasposone si è reinserito in un altro lucus del genoma, si era originato un revertente. Questa pianta revertente è stata auto-fecondata per ottenere una progenie da usare negli esperimenti come linea di riferimento wild type.
In parallelo, l'allele mutante br2 di NC238 è stato introgresso nella linea di riferimento B73.
La presente tesi si suddivide in quattro parti.
Nel primo capitolo sono state introdotte la biologia, morfologia e genetica del mais (Zea Maize). Sono stati descritti la sintesi, il metabolismo e i ruoli dell'ormone auxina. In questa sezione è stata inserita la review dal titolo "The role of auxin transporters in monocot development" ("Il ruolo dei trasportatori di auxina nello sviluppo delle monocotiledoni") scritta durante il periodo all'estero presso il laboratorio del prof. Johal (Università di Purdue, IN). La review descrive le funzioni dei diversi trasportatori di auxina nelle monocotiledoni: mais, riso sorgo e brachipodio, comparandole con i rispettivi ruoli in Arabidopsis, quando trasportatori omologhi esistono. Inoltre una descrizione della struttura e classificazione degli elementi trasponibili delle piante è stata fatta.
Nel secondo capitolo viene descritta l'analisi dei tratti fenotipici. Le pubblicazioni che studiano e caratterizzano i mutanti br2 descrivono difetti nell'allungamento del fusto dovuti alla ridotta lunghezza degli internodi alla base del fusto. Inoltre, difetti nella struttura dei vasi del fusto di br2 sono stati osservati. In un altro caso alterazioni nelle cellule delle foglie e nell'angolo fogliare sono stati descritti. Nessun articolo descrive in dettaglio il sistema radicale di br2. La caratterizzazione della linea br2:NC238 è stata fatta misurando i tratti dell'apparato radicale di piante allo stadio di una settimana. Inoltre sono state eseguite misure fenotipiche su piante in fioritura, coltivate in campo all'azienda agraria sperimentale dell'Università di Padova "L.Toniolo", per identificare eventuali alterazioni dei tratti della pianta. Sono state misurate: la statura delle piante, le distanze, i diametri e il numero dei nodi, l'altezza della spiga più alta, le ramificazioni del pennacchio. Inoltre, è stata fatta una analisi dell'apparato radicale fino a un metro di profondità di suolo. Le radici sono state estratte attraverso carotaggi del terreno alla base del fusto, lavate, scannerizzate e i dati elaborati con un software apposito. Inoltre l'anatomia delle cellule del fusto di br2:NC238 e la loro localizzazione di auxina sono state osservate.
Il terzo capitolo riguarda la caratterizzazione della mutazione a livello genetico. Sono stati amplificati e sequenziati il clone genomico e il trascritto, delle linee br2:NC238 e il suo revertente.
E' stato fatto lo studio dell'inserzione che causa la mutazione in br2:NC238. E' stata analizzata la struttura della sequenza e sono state interrogate banche dati di sequenze genomiche, sequenze ripetute e elementi trasponibili. Inoltre, è stata fatta un'analisi di espressione dei geni codificanti trasportatori di auxina.
Il quarto capitolo riguarda lo studio della linea B73 nella quale l'allele mutato di NC238 è stato inserito. Il clone genomico di abcb1 e il trascritto sono stati amplificati e sequenziati per confermare la mutazione e l'alterazione della trascrizione del gene. Sono state fatte le analisi fenotipiche per confermare che l'allele conferisce le caratteristiche morfologiche anche in linee genotipiche diversi.
In conclusione, le analisi hanno mostrato che il fenotipo di br2:NC238 appare quando le piante hanno 7 foglie. Negli stadi precedenti, br2:NC238 e il revertente sono indistinguibili. Allo stadio di fioritura, br2:NC238 è caratterizzato da ridotta lunghezza degli internodi alla base del fusto e maggior diametro dei nodi bassi. Il resto della pianta è normale.
La mutazione br2 nella linea NC238 è dovuta a un'inserzione di un trasposone in una regione intronica del gene. Il trasposone è caratterizzato da due regioni invertite terminali (TIR) ed è fiancheggiato da due sequenze target dirette duplicate (TSD) che sono presenti anche nelle sequenza genica del revertente. Nonostante la similarità con diversi elementi trasponibili, il trasposone non può essere allocato in nessuna delle famiglie trasposoniche note. A livello trascrizionale, il trasposone altera lo splicing del gene. L'analisi di espressione dei trasportatori di auxina nel fusto allo stadio di 3 e 7 foglie mostra alterazione nei profili di trascrizione. Inoltre, un aumento di espressione della forma di splicing predetta dal Maize Genome Database (T02) è stato osservato.
La presenza dell'allele abcb1 mutato nella linea di riferimento B73 causa l'insorgenza del fenotipo tipico dei mutanti br2. Il risultato indica che l'introgressione dell'allele abcb1 di br2:NC238 in un'altra linea genetica produce una linea di altezza ridotta senza alterare gli altri tratti della pianta e suggerisce la possibilità di introdurre la linea NC238 nei programmi di breeding.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Varotto, Serena
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 28 > Scuole 28 > SCIENZE DELLE PRODUZIONI VEGETALI
Data di deposito della tesi:30 Gennaio 2016
Anno di Pubblicazione:01 Febbraio 2016
Parole chiave (italiano / inglese):Zea Maize, Brachytic 2, Auxin, NC238
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > AGR/07 Genetica agraria
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Agronomia Animali Alimenti Risorse Naturali e Ambiente
Codice ID:9421
Depositato il:21 Ott 2016 10:39
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