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Nogara, Leonardo (2006) Spectroscopic studies of the super relaxed state of skeletal muscle: a possible target for obesity and type 2 diabetes treatments. [Tesi di dottorato]

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Abstract (inglese)

Myosin and muscles have been studied since the beginning of the last century. The high amount of myosin and its optimized purification protocol started the huge field of the molecular motors around 50 years ago. The importance of myosin is not only due to its physiological role but also for its large contribution to the general biochemistry knowledge. Since myosin is a molecular motor, it represented an important step in the connection between chemistry and physics as fields of studies applied to biology. Myosin, as the fulcrum of biochemical conversion of energy into physical work, is the perfect example of the intimate connection between biochemistry and biophysics.
Several techniques have been used to study molecular muscle functions, and so, myosin function. Some of them are common but very powerful, as fluorescence. Some others are less used in biology, such as electronic paramagnetic resonance (EPR). Back in the 1980s, the first papers about EPR measurements on muscle fibers were published. Muscle fibers, and myosin filaments, are not an ordinary biological sample because of their physiological microscopic and macroscopic order. In such samples, EPR, being sensitive to orientation, becomes really informative. EPR was first used on muscle samples to describe the freedom of the myosin head in all the different physiological states it has to go through to complete a cycle. Using these and other techniques, scientists have been working on myosin, characterizing most aspects of the muscle motor protein. There are several models which try to describe the myosin cycle. They may be really detailed and complex. Generally, they all agree on the steps that the myosin has to go through to perform a power stroke. Recently, a new state of myosin has been identified. This state has been called the “Super Relaxed” (SRX) of myosin because when myosin enters this state the ATPase activity is very low.
In this thesis, we aim to characterize myosin behavior especially by studying the stability and the structural details of the super relaxed state.
First we wanted to explore the super relaxed state by modifying one of its components. We expressed mutants of a subunit associated with myosin and that has an important role in the stability of the super relaxed state. The protein has been exchanged into muscle fibers. The idea is to find a way to sense whether the myosin is in the super relaxed state or not. By collecting data on the effects of these mutants labeled with several probes, we were able to identify the mutant/probe couple able to sense the super relaxed state. We used that fluorimetric assay in a high throughput screening, we were looking for a molecule that was able to destabilize the state. Our belief is that the muscle tissue is a good target for increasing basal metabolism in humans, lowering the stability of the slow ATPase state to improve life quality of people affected by obesity and diabetes. A molecule has been identified and it has been shown to be a good leading compound for further pharmacological studies.

Abstract (italiano)

Sin dall’inizio dello scorso secolo la miosina ed il tessuto muscolare sono stati oggetto di ricerca scientifica. Circa 50 anni fa, l’abbondanza della miosina ed il perfezionamento dei protocolli di purificazione hanno contribuito ad iniziare lo studio del grande campo dei motori molecolari. L’importanza della miosina non è solo dovuta al suo ruolo fisiologico, ma anche per il suo grande contributo alla crescita delle conoscenze biochimiche. La miosina è un motore molecolare ed ha rappresentato e rappresenta tuttora un importante anello di congiunzione tra chimica e fisica in quanto campi di studio applicabili alla biologia. La miosina è il fulcro della conversione di energia chimica in lavoro nel tessuto muscolare ed è l’esempio perfetto della intima connessione fra biochimica e biofisica.
Per lo studio delle funzioni molecolari del muscolo e della miosina si sono utilizzate numerose tecniche. Alcune di queste sono ormai piuttosto comuni, e anche molto potenti, quali la fluorescenza. Alcune altre sono meno conosciute in ambito biologico, come l’electron paramagnetic resonance (EPR) o risonanza paramagnetica elettronica, detta anche risonanza di spin elettronico. I primi lavori che vedono protagonista l’EPR su campioni di muscolo risalgono agli anni 80. Le fibre muscolari ed i miofilamenti sono campioni biologici particolari perchè sono fisiologicamente caratterizzati da un elevatissimo ordine microscopico e macroscopico. In tali campioni, l’EPR, essendo sensibile all'orientamento spaziale della molecola paramagnetica che porta l'elettrone spaiato, diventa realmente informativo. L’EPR è stato usato su campioni muscolari per descrivere la libertà di movimento della miosina durante i differenti stati del ciclo di interazione con l'actina. Usando questa ed altre tecniche, gli scienziati hanno studiato la miosina, ottenendo una profonda caratterizzazione di questo motore molecolare. Ci sono diversi modelli che descrivono tutti gli stati o passi che la miosina deve attraversare per completare un ciclo di interazione con l'actina. Recentemente, è stato identificato un nuovo stato della miosina. E’ stato denominato stato “Super Relaxed State” o SRX per via del fatto che è caratterizzato da una attività ATPasica molto bassa.
Lo scopo di questa tesi è di caratterizzare il comportamento della miosina specialmente per quanto riguarda la stabilità e i dettagli strutturali dello stato Super Relaxed.
Il lavoro sperimentale è iniziato con lo studio sullo stato SRX attraverso la modifica di uno dei suoi componenti. Abbiamo espresso mutanti di una proteina associata alla miosina, la catena leggera regolatoria o fosforilabile, che svolge un ruolo fisiologicamente importante per la stabilità dello stato. La proteina mutata è stata sostituita alla forma naturale in fibre muscolari. Lo scopo è di trovare un insieme di proteina mutante marcata con una sonda in grado di identificare quando lo stato SRX è presente. Abbiamo sviluppato quindi un saggio fluorimetrico e abbiamo effettuato un "high throughput screening" al fine di trovare una molecola in grado di destabilizzare lo stato rilassato. Il tessuto muscolare può essere un ottimo bersaglio per aumentare il metabolismo basale, destabilizzando lo stato SRX a basso consumo di ATP e quindi aumentando moderatamente la spesa energetica. Come possibile applicazione, questo potrebbe avere un impatto positivo sulla salute delle persone affette da obesità e diabete di tipo 2. Abbiamo identificato una molecola candidato e abbiamo dimostrato che ha le caratteristiche per essere un buon punto di partenza per sviluppare ulteriori studi farmacologici.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Canton, Marcella
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 28 > Scuole 28 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > BIOCHIMICA E BIOFISICA
Data di deposito della tesi:01 Febbraio 2016
Anno di Pubblicazione:01 Febbraio 2006
Parole chiave (italiano / inglese):muscle, myosin, obesity
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/10 Biochimica
Area 05 - Scienze biologiche > BIO/09 Fisiologia
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Biomediche
Codice ID:9513
Depositato il:20 Ott 2016 14:16
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