Studying oxygenases of biocatalytic interest

Summary The thesis is composed by three chapter. The first chapter deals with the biochemical and biocathalytic characterization of a novel Baeyer-Villiger monooxygenase from the halophilic archibacterium Haloterrigena turkmenica. The second chapter deals with the studying of the functional role of novel Baeyer-Villiger monooxygenases from two photosynthetic organisms: the moss Physcomitrella patens and the red alga Cynidioschyzon merolae. The third chapter deals with the studying of the recombinant expression and the enzymatic activity of the carotenoid cleavage dioxygenase involved in the biosynthesis of saffron in Crocus sativus. 1.1 Chapter I Baeyer–Villiger monooxygenases (BVMOs) are attractive “green” catalysts able to produce chiral esters or lactones starting from ketones. They can act as natural equivalents of peroxyacids that are the catalysts classically used in the organic synthesis reactions, consisting in the cleavage of C-C bonds with the concomitant insertion of an oxygen atom. In this study the gene encoding a Baeyer-Villiger monooxygenase from Haloterrigena turkmenica (Ht), a halophilic archibacterium from the sulfate saline soil of Turkmenistan, was cloned and expressed in Escherichia coli. The recombinant protein, Ht-BVMO, was purified and biochemically characterized. This novel BVMO is the first enzyme of this class that originates from the Archaea domain. The particular amino acid composition of this BVMO is consistent with other halophilic enzymes, which are characterized by a large number of negatively charged aminoacids on their surface to prevent the precipitation in high salt environments. Some ketone compounds described as standard substrates of BVMOs have been tested in enzymatic assays and the effect of salt concentration on the enzyme was studied using different kinds of inorganic salts at different concentration. A clear salt-dependent activity was observed, with no detectable activity in the absence of salt and maximum activity in molar salt concentrations. Despite the particular conditions required for the enzyme to be functional, we investigated the biocatalityc potential of Haloterrigena turkmenica Baeyer Villiger monooxygenase (Ht-BVMO) in converting the ketone substrates into ester products. The main issue that we had to face was finding the proper reaction conditions useful for both a halophilic enzyme and a mesophilic NADPH regeneration enzyme. We tested the residual activity of both enzymes in a range of NaCl concentrations and chose to carry out the bioconversions in 1 M NaCl. In this condition the enzymes resulted stable and all the tested substrates were completely converted. As salt tends to greatly reduce water activity of the medium, halophilic enzymes are though to have interesting applications in biocatalytic processes performed in low water activity environments, like aqueous/organic media. In order to probe the potentialities of Ht-BVMO in these kind of media, the effect of various organic solvents was evaluated on the catalytic activity. Results shows that salt at high concentration, essential to maintain the enzymatic activity of the halophilic enzyme under standard conditions, may be partially replaced by organic solvents. The new enzyme, beside widening the panel of available Baeyer-Villiger monooxygenases, displays peculiar biochemical properties and tolerance to organic solvent that render it interesting for biotechnological applications. 1.2 Chapter II All identified Baeyer-Villiger monooxygenases originate from bacteria or fungi and most of them work in catabolic pathway, in which they are involved in the degradation of organic molecules. Two novel BVMOs from an acidophilic red alga, Cyanidioschyzon merolae, and the moss Physcomitrella patens have been recently cloned and expressed in recombinant form. These two proteins are the first Baeyer-Villiger monooxygenases found in photosynthetic organisms. To characterize these new enzymes several known BVMO substrates were tested. The enzymes showed a slight preference for long chain aliphatic ketones; however, the catalytic activity resulted rather low. Their activity on long chain aliphatic ketones, already verified in vitro, raises the hypothesis of a possible involvement of these BVMOs in the degradative or synthetic pathways of photosynthetic pigments. To study the physiological function of these novel enzymes, so far unexplored in photosynthetic organisms, but also to probe their effective biocathalytic potentialities, we are interested in discovering their natural substrate. To this aim, we have chosen a reverse genetic approach. It is known that both Physcomitrella patens and Cyanidioschyzon merolae are organisms prone to homologous recombination. Physcomitrella patens, in particular, is a well-known model organism. Gene targeting techniques have been widely applied to P. patens, providing useful information for understanding plant evolution mechanisms. We obtained BVMO knock-out mutants, for this organism, but unluckily we were not able to identify a clear phenotype associated with the null mutants. The chromatographic profiles of the photosynthetic pigments extracted from the wild type moss and the BVMOs knock-out mutants were compared, but no significant variations emerged. On the other hand, Cyanidioschyzon merolae is an acidophilic unicellular red alga whose nuclear and plastidial genomes have been sequenced. Although gene targeting has been already reported [95], routine tools and methods are still missing. We planned to produce a BVMO knock-out of this alga, reverting the prototrophy in a Cyanidioschyzon merolae mutant (called M4) that shows auxotrophy for uracil. Using the M4 mutant as recipient, we planned to disrupt the BVMO gene using a DNA construct composed by the wild type URA 5.3 (the gene encoding the orotidine 5’-monophosphate decarboxylase in C. merolae) as marker gene and the 5’ and 3’ sequence of the BVMO as flanking regions for the homologous recombination. The techniques for laboratory cultivation and genetic manipulation for this organism still require optimizations and although we were able to growth the alga in both liquid and solid medium, the attempts to obtain transformants resulted unsuccessful. 1.3 Chapter III Carotenoid cleavage dioxygenases are enzymes that catalyse the cleavage of carbon double bond in organic molecules. The possibility to use these enzymes for biocatalytic applications caught the interest of many chemical companies. Unlike other biocatalysts that catalyse the double bond cleavage (e.g peroxygenases), carotenoid dioxygenases are characterized by an exquisite regiosectivity and are not affected by promiscuous activities that can produce side-products. Most of CCDs are able to accept a broad range of carotenoids, but their cleavage activity shows a strict selectivity towards the position of the double bond in the substrate. The initial aim of the project was to evaluate the in vitro activity of CsZCD, the enzyme identified as responsible of the zeaxanthin cleavage at the position 7-8 (7’, 8’) in Crocus sativus. Controversial data are reported in literature about the reproducibility of the enzymatic activity of this protein [124, 125] and, in 2014, a novel carotenoid cleavage dioxygenase, the Cs-CCD2, was identified as the enzyme that cleaves the zeaxanthin at the 7-8 (7’-8’) position in Crocus sativus [120]. We decided to include also this enzyme of more recent identification into our study. Therefore, we aimed to characterize the ZCD and the novel CCD2, exploring their potential as enzymes useful for biocatalytic processes. Carotenoid cleavage dioxygenases are enzymes characterized by a low solubility and often they are studied as fusion protein, with glutathione s-transferase or thioredoxin as fusion-partners. In order to enhance the solubility of ZCD and CCD2 from Crocus sativus and facilitate their purification, the recombinant form of these enzymes were tagged with the glutathione s-transferase and the thioredoxin. Although both the enzymes showed a high expression level in E.coli, they were purified with a very low yield. The activity of the purified proteins and the cell lysate of E.coli, expressing these enzymes, were tested in vitro. The enzymatic assay was carried out on the natural substrate of these enzyme, zeaxanthin, and the results were analysed by HPLC chromatography. The chromatographic profiles of the reactions did not show the formation of the cleavage products, the 3-OH-β-apo-8’-carotenal and crocetin dialdheyde, therefore the enzymatic cleavage activity was not detected. Our results led to the conclusion that the produced enzymes were inactive, probably due to an incorrect protein folding that led to a tertiary structure not functional for the enzymatic activity.

Sommario La tesi si divide in tre capitoli. Il primo capitolo tratta della caratterizzazione biochimica e biocatalitica di una nuova Baeyer-Villiger monoossigenasi dall’ Archea alofilico Haloterrigena turkmenica. Il secondo capitolo tratta lo studio del ruolo funzionale di due Baeyer-Villiger monossigenasi da organismi fotosintetici: il muschio Physcomitrella patens e l’alga rossa Cyanidioschyzon merolae. Il terzo capitolo tratta lo studio dell’espressione ricombinante e dell’attività di ossigenasi di CCDs (carotenoid cleavage oxygenases) coinvolte nella biosintesi dello zafferano in Crocus sativus. 1.1 Capitolo I Le Baeyer-Viliger monoossigenasi (BVMOs) sono biocatalizzatori che sono in grado di produrre esteri chirali o lattoni a partire da chetoni. Come catalizzatori possono svolgere un ruolo equivalente a quello dei peracidi che sono convenzionalmente utilizzati in chimica organica sintetica, ossia quello di rompere il legame C-C di molecole organiche inserendo un atomo di ossigeno. In questo studio il gene codificante la putativa Baeyer-Villiger monoossigenasi da Haloterrigena turkmenica (Ht), un Archaea alofilo originario del terreno solforico delle saline del Turkmenistan, è stato clonato ed espresso in E. coli. La proteina ricombinante, Ht-BVMO, è stata purificata e caratterizzata biochimicamente. Questa nuova BVMO è il primo enzima di questa classe identificato in un Archaea. La particolare composizione amminoacidica di questa BVMO è coerente con quella di altri enzimi alofili, ed è caratterizzata da un’alta percentuale di amminoacidi carichi negativamente sulla superficie che hanno la funzione di prevenire l’aggregazione proteica in presenza di alte concentrazioni di sale. Alcuni substrati chetonici, considerati substrati standard delle BVMOs, sono stati testati in saggi enzimatici e l’effetto della concentrazione del sale sull’enzima è stata valutata usando diversi tipi di sali inorganici a concentrazioni diverse. L’enzima ha mostrato un’attività dipendente dalla concentrazione di sale, in particolare è risultato totalmente inattivo in assenza di sale, raggiungendo, invece, l’attività ottimale a concentrazioni molari di sale. Nonostante le particolari condizioni richieste dall’enzima per essere attivo, abbiamo indagato sulla possibilità di utilizzarlo come biocatalizzatore per convertire substrati chetonici in esteri. L’ostacolo principale che abbiamo dovuto affrontare è stata proprio l’aloficità di questo enzima e la necessità di dover accoppiare la sua attività a un enzima di rigenerazione del cofattore proveniente da un organismo mesofilo. Abbiamo testato l’attività residua di entrambi gli enzimi a diverse concentrazioni di NaCl e abbiamo scelto di condurre le bioconversioni in 1M NaCl. In queste condizioni entrambi gli enzimi sono risultati stabili e tutti i substrati testati sono stati completamente convertiti. Poiché il sale ad alte concentrazioni riduce l’attività dell’acqua, gli enzimi alofili sono considerati avere potenziali applicazioni in processi biocatalitici in ambienti con una bassa attività dell’acqua, come le miscele di acqua e solvente organico. Le potenzialità di Ht-BVMO, come biocatalizzatore in miscele organiche, sono state esplorate saggiandone l’attività residua in presenza di diversi solventi organici. I risultati hanno mostrato che le alte concentrazioni di sale, necessarie a mantenere l’attività enzimatica, possono essere parzialmente sostituite dai solventi organici. Questo nuovo enzima, oltre ad ampliare il pannello delle Baeyer-Villiger monoossigenasi disponibili, mostra delle peculiari proprietà biochimiche e una tolleranza ai solventi organici che lo rendono particolarmente interessante per applicazioni biotecnologiche. 1.2 Capitolo II Le Baeyer-Villiger monoossigenasi sono enzimi che sono stati identificati in batteri e funghi e la maggior parte di essi è coinvolta in vie cataboliche per la degradazione di molecole organiche. Recentemente sono state identificate ed espresse in forma ricombinante due nuove BVMOs da un’alga rossa acidofila, Cyanidioschyzon merolae, e da il muschio Physcomitrella patens. Queste due proteine sono le prime Baeyer-Villiger monoossigenasi che sono state identificate in organismi fotosintetici. L’attività catalitica di questi enzimi è stata testata su una vasta gamma di substrati. Gli enzimi hanno mostrato preferenza per substrati chetonici con lunga catena alifatica, tuttavia l’attività catalitica è risultata piuttosto bassa. Per studiare la funzione fisiologica di questi nuovi enzimi, finora inesplorati in organismi fotosintetici, e per indagare ulteriormente sulle loro potenzialità biocatalitiche, siamo interessati a scoprire il loro substrato naturale. La loro attività su substrati chetonici a lunga catena alifatica, già verificata in vitro, ci ha fatto ipotizzare un loro coinvolgimento nelle vie degradative o di sintesi dei pigmenti fotosintetici. Con questo scopo, abbiamo deciso di adottare un approccio di “reverse genetic”. Physcomitrella patens e Cyanidioschyzon merolae sono organismi soggetti a ricombinazione omologa. In particolare, Physcomitrella patens è un organismo modello per il quale le tecniche di “gene targeting” sono state ampiamente sviluppate e applicate per studi evolutivi sulle piante. Siamo stati in grado di ottenere mutanti knock-out per il gene codificante la Baeyer-Villiger monoossigenasi in Physcomitrella, ma non sono stati identificati fenotipi associati a questi mutanti. Per verificare il possibile coinvolgimento di questo enzima nella sintesi o degradazione dei pigmenti fotosintetici, abbiamo confrontato il profillo cromatografico dei pigmenti estratti da un organismo “wild-type” e dai mutanti Knock-out, ma non è stata osservata alcuna variazione significativa nella composizione dell’estratto. Cyanidioschyzon merolae, invece, è un’alga rossa acidofila unicellulare il cui genoma nucleare e plastidiale è stato recentemente sequenziato. Abbiamo progettato di produrre un’alga knock-out per la BVMO revertendo la prototroficità in un mutante di Cyanidioschyzon merolae (chiamato M4) che mostra auxotrofia per l’uracile. Usando Il mutante M4 come ricevente, abbiamo tentato di interrompere la sequenza codificante la BVMO usando un costrutto composto da il gene wild type URA 5.3 (codificante l’orotidina 5’-monofosfato decarbossilasi in C.merolae) fiancheggiato dalle sequenze al 5’ e 3’ della regione codificante la BVMO. Sebbene tecniche di “gene targeting” siano state applicate [95], metodi e strumenti per la modificazione genetica e la coltivazione in condizioni di laboratorio devono ancora essere ottimizzati per questo organismo. Sebbene siamo stati in grado di crescere l’organismo sia in terreno liquido che solido, tutti i tentativi di ottenere transformanti sono risultati vani. 1.3 Capitolo III Le CCDs (carotenoid cleavage dioxygenases) sono enzimi che catalizzano il taglio di un doppio legame carbonio-carbonio in molecole organiche. La possibilità di utilizzare questi enzimi per applicazioni biocatalitiche ha suscitato l’interesse di numerose aziende chimiche. Diversamente da altri enzimi che tagliano il doppio legame C-C (come le perossidasi), le CCDs sono caratterizzate da un’alta regioselettività e la loro attività catalitica non porta a prodotti secondari. La maggior parte delle CCDs accetta come substrati un’ampia gamma di carotenoidi, ma la loro attività catalitica è selettiva nei confronti della posizione del doppio legame nel carotenoide. Lo scopo iniziale del progetto era quello di valutare l’attività in vitro di CsZCD, l’enzima identificato come responsabile dell’attività di taglio della zeaxantina alla posizione 7, 8 (7’, 8’) in Crocus sativus [119]. La riproducibilità dei dati ottenuti dalla caratterizzazione biochimica di CsZCD è oggetto di discussione [124,125], e più recentemente, nel 2014, una nuova carotenoid cleavage dioxygenase, CsCCD2, è stata identificata come responsabile del del taglio ossidativo del doppio legame della zeaxantina alla posizione 7-8 (7’-8’) in Crocus sativus [120]. In questo progetto abbiamo cercato di caratterizzare gli enzimi ZCD e CCD2 con lo scopo di indagare sul loro potenziale di enzimi utili a processi biocatalitici. Le forme ricombinanti di queste proteine sono state fuse a glutatione s-transferasi o a tioredossina per aumentarne la solubilità e facilitarne la purificazione. Sebbene entrambi gli enzimi siano stati altamente espressi in E.coli, la loro purificazione ha portato a rese molto basse. L’attività delle proteine purificate e del lisato cellulare di E. coli contenente gli enzimi di interesse è stata testata in vitro. Il saggio enzimatico è stato condotto sul substrato naturale di questo enzima, la zeaxantina, e i risultati sono stati analizzati con cromatografia HPLC. I profili cromatografici delle reazioni non hanno rilevato la formazione dei prodotti di taglio, il 3-OH-β-apo-8’-carotenale e la crocetina dialdeide, perciò non è stata osservata alcuna attività catalitica per gli enzimi purificati. I risultati portano a concludere che gli enzimi prodotti siano inattivi, probabilmente a causa di uno scorretto ripiegamento durante l’espressione, che ha portato a una struttura terziaria non funzionale all’attività enzimatica.