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Alessio, Enrico (2016) The role of long non-coding RNAs in pathophysiological conditions of skeletal muscle. [Tesi di dottorato]

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Documento PDF (Tesi Dottorato Alessio Enrico) - Versione aggiornata
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Abstract (inglese)

Background. Long noncoding RNAs (lncRNAs) form an abundant class of transcripts that is acquiring an increasing importance due to the roles that some of these molecules have been demonstrated to exert in various biological processes. Unfortunately, the function of the majority of them remains elusive. LncRNA are involved in different epigenetic mechanisms of gene regulation, from chromatin remodelling to post-transcriptional regulation. Since their function is related to their subcellular localization and expression, a genome-wide approach to determine the localization of lncRNAs could greatly improve our understanding of their role in pathophysiology of skeletal muscle.
Results. To investigate the subcellular localization of lncRNAs expressed in single skeletal muscle fibers, we studied their compartmentalization by coupling microarray technique with differential extraction and analysis of nuclear and cytoplasmic RNA. We found that 481 lncRNAs preferentially localize in the nucleus, 655 in the cytoplasm and 297 show an alternate localization depending on muscle type and/or lncRNA isoform. Microarray based lncRNA subcellular localization was validated by Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) on 6 lncRNAs. All FISH tests confirmed the subcellular localization previously evidenced by the microarray approach. We then chose 32 lncRNAs to investigate their expression profile among different tissues. Of this group, 24 appear to be preferentially expressed in skeletal muscle, 5 in the heart, and only 2 have a high expression in the liver. Skeletal muscle can be approximately classified according contractile capacity as fast and slow, reflecting fiber composition and metabolism. For this reason, we tested the group of 32 lncRNAs for expression in fast or slow myofibers using single-cell analysis, evidencing that 9 lncRNAs have a specific fiber expression probably affecting metabolic traits. To identify lncRNAs involved in skeletal muscle atrophy we also investigated their expression in skeletal muscle during denervation and starvation as well as in a mouse model for Amyotrophic Lateral Sclerosis. We then analysed the expression of the same lncRNAs in proliferating and differentiating C2C12 myoblasts both in purified myonuclei and cytoplasm. 20 lncRNAs presented with differential expression during myogenic differentiation.
Conclusions. We localized several lncRNAs inside the skeletal muscle evidencing their preferential expression in this tissue and also in specific myofibers. Moreover, we evidenced that many lncRNAs expressed in the muscle are involved in skeletal muscle atrophy induced by different models and in its differentiation. Finally, we evidenced that lncRNA Pvt1 is able to shuttle between cytoplasm and nucleus during myoblast differentiation in-vitro.

Abstract (italiano)

Background. La classe di trascritti composta dai long non coding RNA (lncRNA) sta acquisendo una crescente importanza a causa dei molteplici ruoli che alcune di queste molecole hanno dimostrato di avere in vari processi biologici. Sfortunatamente, la funzione della maggior parte di questi RNA rimane al momento sconosciuta. I lncRNA sono coinvolti in diversi meccanismi epigenetici di regolazione genica, dal rimodellamento della cromatina alla regolazione post-trascrizionale. Dal momento che la loro funzione è legata alla loro espressione e localizzazione subcellulare, usare un approccio genome-wide per determinare la localizzazione di lncRNA potrebbe migliorare notevolmente la nostra comprensione del loro ruolo nella fisiopatologia del muscolo scheletrico.
Risultati. Per studiare la localizzazione subcellulare dei lncRNA in singole fibre del muscolo scheletrico abbiamo estratto RNA nucleare e citoplasmatico per analizzarlo mediante la tecnica microarray. Abbiamo identificato 481 lncRNA che localizzano preferenzialmente nel nucleo, 655 nel citoplasma e 297 che localizzano in diversi compartimenti a seconda dell'isoforma scelta o del tipo di muscolo analizzato. La localizzazione subcellulare identificata via microarray è stata validata, per 6 lncRNA, mediante Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). Questi esperimenti hanno confermato la localizzazione subcellulare precedentemente identificata con l’analisi microarray. Successivamente abbiamo scelto 32 lncRNA di cui abbiamo studiato il profilo di espressione in diversi tessuti. Di questo gruppo, 24 risultano essere espressi preferenzialmente nel muscolo scheletrico, 5 nel cuore, e 2 nel fegato. Il muscolo scheletrico può essere caratterizzato come veloce o lento a seconda della velocità di contrazione, questa caratteristica è dovuta alla presenza di fibre muscolari che sfruttano un metabolismo ossidativo (contrazione lenta) o glicolitico (contrazione veloce). Per questo motivo, abbiamo analizzato l’espressione degli stessi 32 lncRNA in singole miofibre veloci e lente. Grazie a questa analisi abbiamo evidenziato 9 lncRNA che hanno un’espressione fibra-specifica e sono possibilmente legati al metabolismo. Per identificare lncRNA coinvolti nell'atrofia del muscolo scheletrico abbiamo studiato la loro espressione nel durante denervazione e denutrizione. In aggiunta abbiamo analizzato la loro espressione in un modello murino di sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Abbiamo poi analizzato l'espressione degli stessi lncRNA in colture di mioblasti C2C12, in RNA estratto differenzialmente da nucleo e citoplasma. Abbiamo individuato 20 lncRNA differenzialmente espressi durante il differenziamento miogenico.
Conclusioni. Abbiamo individuato la localizzazione subcellulare di diversi lncRNA nel muscolo scheletrico, evidenziando la loro espressione preferenziale in questo tessuto e individuando in che tipo di fibra sono più espressi. Inoltre, abbiamo evidenziato che l’espressione di molti lncRNA muscolari è alterata durante il differenziamento dei mioblasti e durante l’atrofia indotta da diversi modelli. Infine, abbiamo evidenziato che la localizzazione del lncRNA Pvt1 cambia da citoplasma a nucleo durante il differenziamento dei mioblasti in vitro.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Lanfranchi, Gerolamo
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 28 > Scuole 28 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > GENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE DELLO SVILUPPO
Data di deposito della tesi:01 Febbraio 2016
Anno di Pubblicazione:01 Febbraio 2016
Parole chiave (italiano / inglese):lncRNA muscle localization genomewide
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 Biologia molecolare
Area 05 - Scienze biologiche > BIO/18 Genetica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:9563
Depositato il:21 Ott 2016 10:19
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