Vai ai contenuti. | Spostati sulla navigazione | Spostati sulla ricerca | Vai al menu | Contatti | Accessibilità

| Crea un account

Tedesco, Serena (2016) Activation phenotypes of human monocyte-derived macrophages: methodological approaches and pharmacological modulation by curcumin analogues. [Tesi di dottorato]

Full text disponibile come:

[img]Documento PDF (PhD thesis) - Versione sottomessa
Tesi non accessible fino a 02 Febbraio 2019 per motivi correlati alla proprietà intellettuale.
Visibile a: nessuno

2846Kb

Abstract (inglese)

Under normal conditions macrophages provide immune surveillance and host defense in tissues to maintain homeostasis. However, upon sensing changes in the microenvironment, macrophages become activated, undergoing a morphological and functional switch. Activation of these cells is not an “all-or-none” process, but rather a continuum characterized by a wide spectrum of molecular and functional phenotypes ranging from the “classical” M1 activated phenotype, with a highly pro-inflammatory profile, to the “alternative” M2 phenotype, associated with a beneficial, less inflammatory, protective profile. The possibility to promote a macrophage protective phenotype has therefore become a therapeutic goal in the treatment of inflammatory conditions, and the identification of factors that control cell activation is currently an area of active research. Most studies in the field so far have been performed using primary mouse macrophages or macrophage cell lines, and a variety of monocyte differentiation protocols and macrophage activation markers are used by different labs. Moreover, the pharmacological control of human macrophage polarized activation has not been extensively explored. A number of natural and synthetic compounds, including chalcones and curcumin, the major active component isolated from the turmeric plant Curcuma longa, have been shown to induce effects on macrophage function (including antioxidant, anti-microbial, anti-carcinogenic and anti-inflammatory action) through multiple pharmacological mechanisms, including interference with TLR4 signaling. On these grounds, the specific aims of the present thesis were: a) to test cell models and differentiation protocols other than spontaneous blood-derived macrophage differentiation, namely the THP-1 cell line and CSF-1-driven differentiation, respectively; b) to profile the cytokine pattern into the culture medium, and c) to determine the modulation of phenotypic markers by pharmacological agents, namely curcumin derivatives known to suppress microglial activation through reduced production and release of pro-inflammatory mediators, as well as the underlying mechanisms of action.
Macrophages were differentiated from human PBMCs isolated by density gradient centrifugation, and cultured in RPMI 1640 medium with 10% FBS with CSF-1 for 6 days to obtain resting macrophages (M0). Classical (M1) and alternative (M2) phenotypes were generated using specific cytokines (0.1-1 μg/ml LPS or 20 ng/ml IL-4 plus 5 ng/ml IL-13, respectively) in the presence or absence of curcumin analogues or dexamethasone used a reference compound. Macrophage phenotypes were determined by flow cytometry using fluorocrome-labeled antibodies. Gene expression was analysed using qRT-PCR. The composition of macrophage conditioned media (MCM) was assessed with the Luminex technology. Curcumin analogues were kindly provided by Dr. Federica Belluti (University of Bologna).
When M2 polarization was induced with IL-4/IL-13 for 24h, we observed increased expression of M2 markers compared with M0. In terms of gene expression analysis of the CSF-1 driven macrophages, as expected, M1-polarized macrophages after 6 or 48 h showed higher mRNA levels of TNF-α and IL-1β compared with M0. The increase in mRNA was more marked after 48 h for all genes except TNF-α, which rose more sharply after 6 h. The anti-inflammatory cytokine IL-10 mRNA was unexpectedly more abundant in M1- than in M2-polarized macrophages, and peaked after 6 h. Compared with M0, M2 MCM showed higher levels of anti-inflammatory cytokines including CCL22 and IL-4. In contrast, M1 MCM was associated with higher levels of IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, MCP-1, VEGF and TNF-α. Treatment with the curcumin analogue GG9 as well as CLI095, an inhibitor of TLR4 intracellular domain, reversed the LPS-induced up-regulation of CD80+ (M1) cells. A similar effect was maintained with the double positive CD80+/CCR2+ population. Unlike dexamethasone, which increased the percentage of CD163+ (M2) cells, the curcumin analogue GG9 did not affect M2 markers. Treatment with GG9 significantly blocked IL-1β cytokine production at the cell-bound level, in the protein lysate and in the medium. By contrast, curcumin and GG6 did not affect the levels of intra- and extracellular IL-1β. To investigate intracellular signaling pathways involved in cell activation, we performed Western blot analysis of factors involved in the NF-κB pathway. Activation with LPS significantly decreased the relative expression of IκB-α. By contrast, curcumin and GG6 were able to restore IκB-α amounts as did CLI095, whereas no effect was induced by GG9 treatment.
Therefore, M1 and M2 macrophages showed specific profiles of gene expression and surface markers, which were modulated by pharmacological treatment with dexamethasone or a curcumin analogue. Overall, these data suggest that polarized activation protocols may have an impact on the functional status of macrophages and are critical to further investigate pharmacological macrophage targeting.

Abstract (italiano)

In condizioni normali i macrofagi sono i responsabili della risposta immunitaria e della difesa dell’ospite per mantenere l’omeostasi tissutale. In seguito a stimoli presenti nel microambiente, i macrofagi possono attivarsi, andando incontro a uno switch morfologico e funzionale. L’attivazione di queste cellule non è un processo “tutto o nulla” ma piuttosto un continuum caratterizzato da un ampio spettro di fenotipi molecolari e funzionali, i cui estremi sono rappresentati dal fenotipo definito “classico” o M1, con un profilo pro-infiammatorio, e da quello “alternativo” o M2, anti-infiammatorio e protettivo. La possibilità di promuovere un fenotipo macrofagico protettivo sta diventando un obiettivo terapeutico nel trattamento delle condizioni infiammatorie e l’identificazione di fattori che regolano l’attivazione cellulare è attualmente un’area di ricerca molto attiva. La maggior parte degli studi in questo ambito sono stati condotti utilizzando culture primarie di macrofagi di topo o linee cellulari; inoltre, i vari laboratori usano protocolli diversi di isolamento/differenziamento dei monociti e marcatori diversi di attivazione. Inoltre, il controllo farmacologico dell’attivazione macrofagica non è ancora stato indagato sufficientemente. Una serie di composti naturali e sintetici, ad esempio il calcone e la curcumina, il principale componente attivo della Curcuma longa (pianta nota per effetti anti-ossidanti, anti-microbici, anti-tumorali e anti-infiammatori) hanno dimostrato un effetto sulla funzione dei macrofagi, agendo attraverso diversi meccanismi farmacologici, ad esempio interferendo con il signaling del TLR4. Sulla base di queste premesse, gli scopi specifici di questo lavoro di tesi erano: a) testare un modello cellulare e un protocollo di differenziamento diverso da quello spontaneo, in particolare la linea cellulare monocitaria THP-1 e il differenziamento in presenza di CSF-1; b) determinare il profilo delle citochine presenti nel terreno di coltura e c) determinare la modulazione dei marcatori dei fenotipi di attivazione da parte di agenti farmacologici, in particolare da derivati di sintesi della curcumina, noti per la loro capacità di modulare l’attivazione di cellule murine di microglia attraverso la riduzione della produzione e rilascio di mediatori pro-infiammatori.
I macrofagi sono stati differenziati a partire dai linfo-monociti umani isolati tramite gradiente di densità e coltivati in terreno RPMI + 10% FBS con aggiunta di CSF-1 per 6 giorni, ottenendo così macrofagi in condizioni basali (M0). Il fenotipo classico (M1) e il fenotipo alternativo (M2) sono stati ottenuti incubando i macrofagi M0 rispettivamente con 0.1-1 μg/ml LPS e IL-4 20 ng/ml + IL-13 5 ng/ml, in presenza o assenza di analoghi della curcumina, desametazone o CLI095, un inibitore del dominio intracellulare del TLR4 (questi ultimi utilizzati come composti di riferimento). I fenotipi macrofagici sono stati determinati tramite citofluorimetria utilizzando specifici anticorpi legati a fluorofori. L’espressione genica è stata valutata tramite qRT-PCR. La composizione dei terreni condizionati (macrophage conditioned media, MCM) è stata valutata con la tecnologia Luminex. Gli analoghi
della curcumina sono stati gentilmente forniti dalla Prof.ssa Federica Belluti (Università di Bologna). In seguito a polarizzazione per 24 h con IL-4/IL-13 abbiamo osservato un aumento dell’espressione dei marcatori M2 rispetto a M0. Per quanto riguarda l’espressione genica di macrofagi differenziati con CSF-1, come atteso, i macrofagi M1 dopo 6 o 48h presentavano livelli superiori di mRNA per TNF-α e IL-1β rispetto a M0. L’aumento dell’mRNA era più marcato dopo 48 h per tutti i geni tranne TNF-α, che raggiungeva il picco a 6h. L’mRNA della citochina anti-infiammatoria IL-10 inaspettatamente era più espresso nei macrofagi M1 rispetto a M2 e raggiungeva il picco dopo 6 h. Rispetto a M0, l’MCM M2 era caratterizzato da alti livelli di citochine anti-infiammatorie tra le quali CCL22 e IL-4. Al contrario, l’MCM M1 presentava livelli elevati di IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, MCP-1, VEGF e TNF-α. Il pre-trattamento con l’analogo della curcumina GG9 e il controllo positivo CLI095 ha prevenuto l’aumento indotto da LPS del marcatore M1 CD80. Un effetto simile è mantenuto anche sulla frazione di cellule a doppia marcatura CD80+/CCR2+. Al contrario del desametazone, che aumenta la percentuale di cellule CD163+ (M2), il GG9 non ha modulato i marcatori M2. Il trattamento con GG9 ha bloccato in maniera significativa la produzione di IL-1β valutata come citochina cell-bound, nel lisato cellulare o rilasciata nel terreno di coltura. Al contrario, l’analogo GG6 non ha modificato i livelli di IL-1β intra- ed extra-cellulare. Per indagare più nel dettaglio le vie di segnale coinvolte nell’attivazione di queste cellule, abbiamo effettuato analisi Western Blot di fattori coinvolti nella via di segnale di NF-κB. L’attivazione con LPS ha ridotto significativamente l’espressione relativa di IκB-α. Curcumina, GG6 e CLI095 hanno riportato IκB-α ai livelli di controllo, a differenza del GG9 che non modificava significativamente l’espressione di questa proteina.
Pertanto, i macrofagi M1 ed M2 presentano specifici profili di attivazione genica e di marcatori di superficie che possono essere modulati in seguito a trattamento farmacologico con desametazone o analoghi della curcumina. Nel complesso, questi dati suggeriscono che protocolli di attivazione macrofagica possono avere un impatto sullo stato funzionale di queste cellule e sono fondamentali per definire nuove strategie di targeting farmacologico nei macrofagi umani.

Aggiungi a RefWorks
Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Cignarella, Andrea
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 28 > Scuole 28 > SCIENZE FARMACOLOGICHE > FARMACOLOGIA, TOSSICOLOGIA E TERAPIA
Data di deposito della tesi:01 Febbraio 2016
Anno di Pubblicazione:01 Febbraio 2016
Parole chiave (italiano / inglese):macrophages, polarization, curcumin, immunopharmacology
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/14 Farmacologia
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze del Farmaco
Codice ID:9566
Depositato il:06 Ott 2016 15:58
Simple Metadata
Full Metadata
EndNote Format

Solo per lo Staff dell Archivio: Modifica questo record