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Vara-Messler, Marianela (2016) The role of omega-3 PUFA-enriched diet and DHA metabolites derived from aspirin-acetylated COX-2 on tumor growth and angiogenesis. [Tesi di dottorato]

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Tesi non accessible fino a 02 Febbraio 2019 per motivi correlati alla proprietà intellettuale.
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3801Kb

Abstract (inglese)

Background: Breast cancer (BC) is the most frequent cancer occurring in women. Epidemiological data have linked omega-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFAs) consumption to lower incidence of BC and several experimental studies showed the anti-proliferative effects of n-3 PUFAs in different BC models. Chia oil is rich in alpha-linolenic acid (ALA, 18:3 n-3), while corn oil is rich in linoleic acid (LA, 18:2 n-6). Angiogenesis is a tightly regulated process involving endothelial cells (ECs) proliferation, migration and tube formation. Docosahexaenoic acid (DHA, 22:6 n-3) a downstream metabolite from ALA, has been demonstrated to regulate cancer-related angiogenesis, while arachidonic acid (AA, 20:4 n-6) promotes angiogenesis. In addition, aspirin (ASA) has antineoplastic effects that are mediated at least in part by metabolites derived from acetylated COX-2. The study was aimed to determine a possible role of dietary n-3 PUFAs on BC growth and, in particular, the effect of DHA metabolites from ASA-acetylated COX-2 in the angiogenic process.
Methods: 40 BALB/c mice were fed 1) a Chia Oil (ChO)-rich (n-3), or 2) a Corn Oil (CO)-rich diet (n-6). Afterwards, mice were inoculated with mouse BC cells (LM3) and tumour growth parameters were recorded after 45 days. Mitotic and apoptotic figures, as well angiogenesis in tumour sections were assessed by immunohistochemistry. Human endothelial cells (ECs) were treated with DHA or AA (1-100 microM) for different times in the presence or absence of ASA (50 microM). Selected experiments were performed with 17R-HDHA (100 nM – 3 microM), a DHA metabolite derived from acetylated COX-2. Endogenous production of 17R-HDHA by HUVECs was analyzed by Liquid chromatography-tandem mass spectrometry. EC viability was analyzed with the MTT assay. The angiogenetic capability was evaluated using a) the wound healing assay, b) a chemotaxis chamber, and c) matrigel.
Results: After 45 days tumour incidence was higher in CO-fed compared with ChO-fed mice (100 vs 85%, p<0.05). Tumor weight and volume as well as metastasis number were lower, whereas tumor latency time was longer in ChO-fed mice. Compared to the control group, a higher number of apoptotic bodies, a lower number of mitosis and vessels were consistently observed in the ChO-fed mice group. Given these in vivo findings, we next studied whether n-3 PUFAs had direct anti-angiogenic actions on human ECs. Cells were viable when treated with up to 50 microM DHA or AA in the presence or absence of ASA for 24h. Challenging the cells with 17R-HDHA for 24h did not affect cell viability. EC migration, as evaluated by wound healing assay, was significantly decreased in cells pretreated for 24h with 30 microM, but not 10 microM DHA compared to control. Interestingly, 10 microM DHA in the presence of 50 microM ASA significantly inhibited ECs migration (-36%±5.4%, p<0.001) already after 24h. By contrast, AA did not affect EC migration at any concentration tested (1-30 microM) in the presence or absence of ASA. Consistently, ECs treated with DHA+ASA produced higher amounts of 17R-HDHA with respect to cells treated with DHA alone. Pretreatment with 17R-HDHA (1-3 microM, 24h) decreased EC migration (-12%±4.1% and -28%±1.9%, p<0.05 and p<0.01, respectively) evaluated by the wound healing assay. Additionally, 17R- HDHA (300 nM, 1 or 3 microM, 6h) reduced EC migration as evaluated in a micro chemotaxis chamber (-20%±1.4%, -30%±4.0% and -65%±3.5%, p<0.01 and p<0.001, respectively), while DHA did not show any effect. Furthermore, 17R-HDHA inhibited EC tube formation after a 6h treatment. In particular, nodes, meshes and mesh area were significantly lower in 10 microM DHA-treated cells in the presence of 50 microM ASA, as well as in 17R-HDHA (300 nM-3 microM)-treated cells.
Conclusion: In vivo and ex vivo data point to a central role of n-3 PUFAs in BC growth. In vitro data demonstrate that aspirin-acetylated COX-2 enhances the anti-angiogenic effects of DHA and may have a role in the setting of tumors.

Abstract (italiano)

Background: Il tumore alla mammella (TM) è il tumore più frequente che si verifica nelle donne. Dati epidemiologici hanno collegato l’assunzione degli acidi grassi polinsaturi omega-3 (n-3 PUFA) con la minore incidenza di TM e diversi studi sperimentali hanno dimostrato gli effetti anti-proliferativi di n-3 PUFA in diversi modelli di TM. L’olio di chia è ricco di acido alfa-linolenico (ALA, 18:3 n-3), mentre l'olio di mais è ricco di acido linoleico (LA, 18:2 n-6). L'angiogenesi è un processo strettamente regolato che coinvolge la proliferazione, la migrazione e la formazione di capillari da parte delle cellule endoteliali (CE). L’acido docosaesaenoico (DHA, 22:6 n-3), un metabolita a valle dell’ALA, è stato dimostrato essere in grado di regolare l'angiogenesi correlatea al tumore, mentre l'acido arachidonico (AA, 20:4 n-6) promuove l'angiogenesi. Inoltre, l'aspirina (ASA) ha effetti antineoplastici che sono mediati, almeno in parte, da metaboliti derivati dall’acetilazione della COX-2. Lo scopo dello studio è stato quello di determinare il ruolo degli n-3 PUFA sulla crescita del un tumore alla mammella e, in particolare, di valutare l'effetto di metaboliti derivati dalla COX-2 acetilata in presenza di DHA nell'angiogenesi.
Metodi: 40 topi BALB/c sono stati nutriti con 1) una dieta ricca di n-3 PUFA contenente il 10% di olio di chia (ChO); o 2) una dieta ricca d n-6 PUFA contenente il 10% d’olio mais (CO). In seguito, i topi sono stati inoculati con una linea di cellule tumorali (LM3) per indurre il tumore primario ed i parametri di crescita tumorale sono stati registrati dopo 45 giorni. Nelle sezioni di tessuto tumorale sono state valutate le cellule mitotiche ed apoptotiche e l'angiogenesi mediante immunoistochimica. Gli esperimenti in vitro sono stati condotti con cellule endoteliali umane (HUVECs). Le HUVECs sono state trattate con DHA o AA (1-100 microM) per diversi tempi in presenza o assenza di ASA (50 microM). Inoltre, alcuni esperimenti sono stati effettuati con 17R-HDHA (100 nM – 3 microM), un metabolita derivato dalla COX-2 acetilata in presenza di DHA. La produzione endogena di 17R-HDHA da parte delle HUVECs è stata analizzata mediante spettrometria di massa. La citotossicitá dei composti è stata valutata con il test MTT. La capacità angiogenica delle HUVECs è stata valutata utilizzando a) il saggio della chiusura della ferita, b) la chemiotassi in camera di di Boyden e c) la formazione dei capillari con il saggio di matrigel.
Risultati: Dopo 45 giorni l'incidenza tumorale era più alta nei topi sottoposti a dieta con olio di mais (CO) rispetto a quelli alimentati con la dieta chia (ChO) (100 vs 85%, p <0.05). Il peso tumorale ed il volume del tumore, così come il numero delle metastasi erano più bassi nei topi che avevano ricevuto la dieta ChO, mentre il tempo di latenza del tumore è risultato più lungo nei topi alimentati con la dieta ChO. Inoltre, nel gruppo di topi sottoposti a dieta ChO sono state osservateun maggior numero di cellule apoptotiche, un minor numero di cellule mitotiche cosí come un minor numero di vasi rispetto al gruppo di controllo (CO). Alla luce di questi risultati in vivo, abbiamo studiato se n-3 PUFA avevano attivitá anti-angiogenica diretta sulle CE umane. Non abbiamo osservato variazioni nella vitalità delle cellule endoteliali trattate con DHA fino a 50 microM o AA, in presenza o assenza di ASA per 24h, cosí come nelle cellule trattate con 17R-HDHA. La migrazione delle CE valutata mediante il saggio di chiusura della ferita, è significativamente diminuita rispetto al controllo nelle cellule pretrattate per 24 ore con 30 microM DHA, ma non in quelle pretrattate con 10 microM DHA. Tuttavia, è interessante sottolineare che 10 microM DHA in presenza di 50 microM ASA ha inibito significativamente la migrazione delle CE (-36%±5.4%, p<0.001) già dopo 24 ore. Per contro, AA in presenza o assenza di ASA non ha influenzato la migrazione cellulare a nessuna delle concentrazioni valutate (1-30 microM). In linea con questi risultati, le HUVECs trattate con DHA in presenza d’ASA ha prodotto una maggiore quantità di 17R-HDHA rispetto alle cellule trattate con solo DHA. Inoltre, il pretrattamento per 24h con 17R-HDHA (1-3 microM) ha diminuito la migrazione delle cellule endoteliali valutata con il test di chiusura della ferita (-12%±4.1% and -28%±1.9%, p<0.05 e p<0.01, rispettivamente). Inoltre, 17R-HDHA (300 nM, 1-3 microM per 6 ore) ha ridotto la migrazione cellulare valutata in una camera di chemiotassi (-20%±1.4%, -30%±4.0% and -65%±3.5%, p<0.01 e p<0.001, rispettivamente), mentre DHA da solo non ha mostrato alcun effetto. Inoltre, 17R-HDHA ha diminuito la formazione di strutture capillaro-simili dopo 6 ore. In particolare, valutando diversi parametri, si è visto che i nodi, le maglie e la zona delimitata dalle maglie erano significativamente più bassi nelle cellule trattate con 10 microM DHA in presenza di 50 microM ASA, così come in quelle cellule trattate con 17R-HDHA (300 nM - 3 microM).
Conclusione: i risultati in vivo in un modello murino di tumore al seno, mettono in luce un ruolo degli n-3 PUFA nella crescita tumorale. I risultati in vitro dimostrano che l’acetilazione della COX-2 da parte dell’aspirina porta alla produzione di metaboliti che potenziano gli effetti anti-angiogenici di DHA e possono avere un ruolo nel tumore.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Bolego, Chiara
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 28 > Scuole 28 > SCIENZE FARMACOLOGICHE > FARMACOLOGIA, TOSSICOLOGIA E TERAPIA
Data di deposito della tesi:01 Febbraio 2016
Anno di Pubblicazione:01 Febbraio 2016
Parole chiave (italiano / inglese):angiogenesis, fatty acids, COX-2, aspirin
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/14 Farmacologia
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze del Farmaco
Codice ID:9567
Depositato il:06 Ott 2016 14:55
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