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Barbieri, Elisa (2016) Explorin the role of FIS1 in mitochondrial (patho)physiology. [Tesi di dottorato]

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Tesi non accessible fino a 01 Aprile 2019 per motivi correlati alla proprietà intellettuale.
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Abstract (inglese)

Mitochondria are key players in a plethora of (patho)physiological processes and show a striking morphological and structural versatility, which is ensured by inter-organellar fusion and fission processes mediated by a group of dynamin-related ATPases and their adaptor proteins, the so-called mitochondrial shaping proteins (Friedman and Nunnari, 2014; Hoppins et al., 2007a). Mitochondrial fission requires the translocation of cytosolic dynamin-related protein 1 (DRP1) to the mitochondria and its interaction with FIS1, MFF and MiD49/50, its putative receptors.
FIS1 is a tail-anchored protein evenly distributed on the outer mitochondrial membrane and composed by a C-terminus transmembrane (TM) domain and two cytosolic tetratricopeptide repeat (TRP) motifs (James et al., 2003; Stojanovski et al., 2004; Yoon et al., 2003). FIS1 has been proved to mediate mitochondrial-ER tethering, ER-gated apoptosis, autophagy and ischemia/hypoxia-induced fragmentation (Alirol et al., 2006; Iwasawa et al., 2011a; Kim et al., 2011; Shen et al., 2014; Yamano et al., 2014). However, the discovery of MFF and MiD49/50, along with the finding that both DRP1 recruitment and mitochondrial fragmentation take place also in two models of Fis1 in vitro ablation, led to partially discharge FIS1 involvement in such events (Loson et al., 2013; Otera et al., 2010; Palmer et al., 2013). Besides the mechanistic aspects of FIS1-mediated fragmentation, its (patho)physiological relevance is still far from been clarified, and no human pathology has been directly linked to a mutation in Fis1 gene so far.
In order to place FIS1 functions into a physiological context and to further define the relevance of mitochondrial fission in vivo, we decided to generate a hypomorphic Fis1 mouse model (Fis1hyp allele) that could be turned into a conditional ablation system (Fis1fl allele). The powerful genetic tool we generated circumvents many of the potential pitfalls of the most commonly used gene targeting approaches.
We showed that Fis1 hypomorphism causes a perinatal pleiotropic lethal phenotype, comprising severe progressive muscular atrophy, heart ischemia and compromised vessel integrity. The concomitant muscular atrophy and heart ischemia would suggest (cardio)myopathy and/or neuromuscular defects, whereas extensive blood clots in the thorax, the presence of blood in the lungs and in the intestine and the altered microcircular bed in the retina seem to suggest defects in the maintenance of vessel integrity and/or increased vessel permeability and consequent blood leakage. Remarkably, although reduced, also heterozygous mice display lethality at a later stage and show defects comparable to their Fis1hyp/hyp littermates, thus suggesting a dose dependent relationship between phenotype severity and extent of Fis1 gene ablation.
In vitro, we observed mitochondrial elongation and upregulation of the fission machinery as a consequence of Fis1 hypomorphism.
Furthermore, we showed that expression of both human and mouse Fis1 genes is controlled by multiple splicing. In particular, an exon-skipping event of conserved exon 2 dictates the preferential expression of variant 2 versus the canonical variant 1 in both species. Remarkably, a non-canonical START codon seems to be responsible for transcription of human variant 2 (hFis1.2). The resulting protein, although lacking only the first 18 amino acids, triggers mitochondrial elongation when overexpressed in mouse. Upon starvation, Fis1 variant 2 expression is up-regulated in a protein kinase A dependent manner and its specific knockdown inhibits autophagy-associated mitochondrial elongation. Thus, Fis1 is alternatively spliced to modulate mitochondrial morphology during autophagy.

Abstract (italiano)

I mitocondri svolgono una funzione chiave in una serie di processi (pato)fisiologici e presentano una sorprendente versatilità morfologica e strutturale, assicurata da processi di fusione e fissione mitocondriali. Quest’ultimi sono mediati da un gruppo di ATPasi simili alla dinamina e dalle loro proteine adattatrici, dette mitochondrial shaping proteins (Friedman and Nunnari, 2014; Hoppins et al., 2007a). La fissione mitocondriale richiede la traslocazione di dynamin related protein 1 (DRP1) dal citosol ai mitocondri e la sua interazione con FIS1, MFF e MiD49/50, i suoi recettori putativi.
In particolare, FIS1 è una proteina legata alla membrana mitocondriale via l’N-terminale, distribuita in maniera regolare nella membrana e composta da un dominio transmembrana C-terminale (TM) e due motivi a ripetute tetratricopeptidiche (TRP) citosolici (James et al., 2003; Stojanovski et al., 2004; Yoon et al., 2003). E’ stato dimostrato che FIS1 media il collegamento tra mitocondri e reticolo endoplasmatico (ER), l’apoptosi via ER, l’autofagia, e la frammentazione mitocondriale indotta da ischemia/ipossia (Alirol et al., 2006; Iwasawa et al., 2011a; Kim et al., 2011; Shen et al., 2014; Yamano et al., 2014). Tuttavia, la scoperta di MFF e MiD49/50, insieme ai risultati sperimentali che sia il reclutamento di DRP1 che la frammentazione mitocondriale si svolgono anche in due modelli di ablazione di Fis1 in vitro, hanno portato in parte a smentire il coinvolgimento di FIS1 in tali eventi (Loson et al., 2013; Otera et al., 2010; Palmer et al., 2013). Oltre agli aspetti meccanicistici della frammentazione mediata da FIS1, la sua rilevanza (pato)fisologica è tutt’altro che chiara e fino ad ora nessuna patologia umana è stata legata direttamente a mutazioni nel gene Fis1.
Per collocare le funzioni di FIS1 in un contesto fisiologico e meglio definire l’importanza della fissione mitocondriale in vivo abbiamo deciso di generare un modello murino ipomorfico di Fis1 (allele Fishyp) che possa essere convertito in un sistema per l’ablazione condizionale di Fis1 (allele Fis1fl). Il potente strumento genetico da noi generato evita molti dei potenziali problemi caratteristici degli approcci più comunemente usati per intervenire su un gene.
Abbiamo scoperto che l'ipomorfismo di Fis1 causa un fenotipo pleiotropico con letalità perinatale che comprende una grave atrofia muscolare progressiva, ischemia cardiaca e danni all'integrità dei vasi sanguigni. L’atrofia muscolare in concomitanza con ischemia cardiaca parrebbe suggerire una (cardio)miopatia e/o difetti neuromuscolari, mentre gli estesi coauguli nel torace, la presenza di sangue nei polmoni e nell'intestino, e la microcircolazione alterata nella retina paiono suggerire difetti nel mantenimento dell’integrità dei vasi sanguigni e/o un aumento della permeabilità dei vasi sanguigni con conseguenti emorragie.
Anche topi eterozigoti mostrano letalità, benché in misura ridotta ed ad uno stadio più tardo, e hanno difetti comparabili a quelli esibiti dai topi Fis1hyp/hyp, suggerendo così una relazione dose-dipendente tra severità del fenotipo ed entità dell’ablazione del gene Fis1. Per verificare tale ipotesi è necessaria una misura della produzione residuale di mRNA di Fis1 via 5’RACE seguita da una correlazione tra i livelli residuali di mRNA di Fis1 in topi Fishyp/+ e severità del fenotipo.
In conseguenza dell'ipomorfismo di Fis1 abbiamo osservato in vitro un’elongazione dei mitocondri e una regolazione su livelli più alti delle proteine coinvolte nella fissione mitocondriale.
Un altro risultato è stato la dimostrazione che l’espressione dei geni Fis1 umano e murino è controllata da splicing multiplo. In particolare, un evento di salto di esone dell’esone 2, conservato in entrambe le specie, determina l’espressione preferenziale della variante 2 rispetto alla variante canonica 1 in entrambe le specie. E’ notevole che un codone START non canonico sembri essere responsabile della trascrizione della variante umana 2 (hFis1.2). La proteina risultante, benché manchi solo dei primi 18 amminoacidi, induce elongazione dei mitocondri se overespressa in topo. In caso di starvation, l’espressione della variante 2 di Fis1 viene regolata su livelli più alti in maniera dipendente da protein kinase A e il suo knockdown specifico inibisce l’elongazione mitocondriale indotta da autofagia: ne deriva che Fis1 è soggetto ad uno splicing alternativo per modulare la morfologia mitocondriale durante l’autofagia

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Scorrano, Luca
Correlatore:Scorrano, Luca
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 28 > Scuole 28 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > BIOCHIMICA E BIOFISICA
Data di deposito della tesi:01 Febbraio 2016
Anno di Pubblicazione:01 Febbraio 2016
Parole chiave (italiano / inglese):mitochondria, mitochondrial fragmentation, splicing variants, heart, muscles, blood vessels
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 05 - Scienze biologiche > BIO/10 Biochimica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:9575
Depositato il:21 Ott 2016 10:40
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