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Marrano, Annarita (2013) Genome-wide patterns of genetic variation among wild and cultivated grapevines (V. vinifera L.). [Tesi di dottorato]

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Tesi non accessible fino a 12 Marzo 2020 per motivi correlati alla proprietà intellettuale.
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Abstract (inglese)

Grapevine (V. vinifera L.) is one of the most important crops worldwide due to its global distribution and economic value. Two forms of grapevine still co-exist nowadays: the cultivated form V. vinifera subsp. sativa and the wild form V. vinifera subsp. sylvestris, which is considered the ancestor of present cultivars. Archeological and historical findings suggest that cultivated grapevines have been domesticated from wild populations of V. sylvestris circa 8,000 BP in the Near East. However, recent genetic analyses raised the outstanding question whether multiple domestication events occurred. During domestication the biology of grapes changed dramatically to guarantee greater yield, higher sugar content and more regular production. The changes in berry and bunch size as well as the transition from dioecious wild plants to hermaphrodite cultivated grapes were crucial. Additional studies on the genetic relationship between wild and cultivated grapevines are required in order to understand how this phenotypic evolution occurred and to clarify the process of adaptation to domestication in grapevine. This will be useful for the future genetic improvement of viticulture.
In this regard, we investigated the genetic and phenotypic variation within a germplasm collection of wild and cultivated grapevine accessions. The whole population was first genotyped with the commercial GrapeReSeq Illumina 20K SNP array, yielding 16K good quality single nucleotide polymorphisms (SNPs). Afterwards, a novel Restriction Associated DNA-sequencing (RADseq) procedure was developed in order to further increase the density of molecular markers across the grapevine genome. By applying this novel RAD-seq protocol to the whole population, 37K SNPs were identified, which reflected a considerable level of genetic diversity between sativa and sylvestris accessions. The two merged SNP matrices were filtered for SNP loci with a missing rate > 0.2 and a minor allele frequency (MAF) < 0.05. The final panel of 27K SNPs evenly distributed along the grapevine genome was used to investigate the population structure by using both Principal Component Analysis (PCA) and the cluster algorithm implemented in fastSTRUCTURE software. In line with previous research, both analyses highlighted a low but clear differentiation between sativa and sylvestris individuals. Therefore, the extent of Linkage Disequilibrium (LD) was evaluated within the whole grapevine population and in the two subspecies separately. LD, as measured by the classical r2 correlation coefficient, decayed below 0.2 within 10 kb in the whole population. On the other hand, a slower LD decay was observed in the wild compartment, where r2 reached values below 0.2 within 20 kb. This result can be related with an elevated level of inbreeding among wild individuals, linked to a small effective population size and the missing gene-flow between wild populations.
Population differentiation statistic (FST) was computed across the grapevine genomes looking for genomic regions with divergent allele frequencies between the two grapevine subspecies. An overall low level of genetic differentiation (FST = 0.12) was observed between cultivated and wild grapes, suggesting the occurrence of genetic exchange among the two subspecies. However, a non-random distribution of divergent sites was observed along the whole genome: over two thousands of SNP loci revealed a significant level of differentiation between sativa and sylvestris, validated empirically with a permutation test. 1,714 annotated genes were found in LD with these most significant SNPs, and showed an enrichment of predicted functions related to the metabolic processes of nitrogen and carbohydrate as well as to the perception and adaptation to environmental stimuli. A slightly reduction of nucleotide diversity in the sylvestris (πsylvestris/ πsativa ~0.95) was observed in almost all the identified genes involved in stress responses, suggesting that a selection is likely acting in wild populations for adaptation to several environmental changes. Therefore, these results point the attention towards sylvestris grapevines as valuable resources of resilience genes or alleles, which may have been lost in cultivated grapevine during the domestication process.
Genome-wide association study (GWAS) approach has been applied as an alternative strategy to identify the genes and mutations that have been targets of selection during crop domestication. Therefore, the germplasm collection of cultivated and wild grapevines has been evaluated in two years for single berry and single bunch weight, number of bunches per plant, yield and berry composition (sugar, organic acid and K+ concentrations, titratable acidity and pH). A great phenotypic variation was observed within and between the two grapevine subspecies, notably for berry size, pH, acid contents and titratable acidity. The association test, carried out accounting for confounding factors, identified significant genotype-phenotype correlations for all traits, except for single berry weight. Genes encoding proteins related to Ca2+ sequestration and signalling, transcription factors and enzymes involved in the metabolism of polyamines were identified in linkage with the SNPs significantly associated to yield and bunch weight. At the same time, genes with a central role in the control of berry flesh pH and acidity were detected, such as the isocitrate lyase and V-type proton ATPase subunit a3 genes.
Therefore, the present research has proven for the first time the feasibility of population genetics and association mapping approaches for dissecting the genomic basis of phenotypic variation in a complex genetic system as grapevine. Moreover, further evidence of the relevance of wild grapevine as a model for understanding the mechanisms of adaptation to natural conditions has been provided. These results pave the way for understanding how wild and cultivated grapevines react to environmental stimuli, which will benefit the development of new breeding strategies to face the ongoing climate changes and the growing demand of a sustainable viticulture.

Abstract (italiano)

La diffusione geografica e l’importanza economica della viticoltura fanno della vite euroasiatica (V. vinifera L.) una delle specie più importanti per l’agricoltura mondiale. La maggior parte dei vitigni coltivati appartengono alla sottospecie V. vinifera subsp. sativa, la quale si ritiene sia stata domesticata nel vicino Oriente dalla vite selvatica (V. vinifera subsp. sylvestris) intorno al IV millenio a.C. Tuttavia, studi recenti hanno sollevato l’ipotesi di eventi di domesticazione secondaria della vite coltivata in Europa occidentale. Si pensa che il passaggio da viti selvatiche dioiche a viti con fiori ermafroditi sia stato fondamentale per la domesticazione della vite, dal momento che la capacità di produrre frutti per autofecondazione garantiva una produttività superiore e costante di uva. Altrettanto importante è stata la selezione per caratteristiche dell’uva di immediata percezione, come per esempio la dimensione della bacca ed il suo contenuto zuccherino. Studi aggiuntivi sulle relazioni genetiche tra la vite coltivata e la sua forma spontanea sono necessari allo scopo di chiarire la serie di incertezze che ancora persistono sull’origine della vite domestica ed incentivare il miglioramento genetico della viticoltura attuale.
Pertanto, il principale obiettivo del presente lavoro di tesi è stato la caratterizzazione della variabilità fenotipica e genetica di una collezione di viti coltivate e selvatiche. L’intera popolazione è stata genotipizzata con il nuovo GrapeReSeq 20K SNP chip, ottenendo una matrice finale di 16 mila marcatori SNP di alta qualità. Allo stesso tempo, un nuovo protocollo della tecnologia RAD-seq è stato messo a punto con lo scopo di incrementare la densità dei marcatori molecolari lungo il genoma di vite. In seguito all’applicazione di questa nuova procedura di RAD-seq all’intera collezione di viti, circa 37 mila marcatori SNP sono stati identificati, mettendo in evidenza una cospicua diversità genetica tra la vite coltivata ed il suo presunto progenitore. L’unione delle due matrici di marcatori SNP, seguita dalla rimozione dei loci con un tasso di dati mancanti superiore a 0.2 ed una frequenza dell’allele minore (MAF) inferiore a 0.05, ha portato alla formazione di un panel definitivo di circa 27 mila marcatori SNP, equamente distribuiti lungo il genoma di vite. Questo panel finale di marcatori SNP è stato utilizzato per analizzare la struttura della popolazione attraverso due approcci complementari, ossia l’analisi delle componenti principali (PCA) e l’approccio bayesiano implementato nel programma fastSTRUCTURE. In accordo con quanto riportato in letteratura, entrambe le strategie hanno messo in evidenza una chiara e moderata differenziazione tra le accessioni di V. sativa e V. sylvestris. Pertanto, l’estensione del Linkage Disequilibrium (LD), espresso sottoforma del classico coefficiente di correlazione r2, è stata valutata nell’intera collezione e nei due sottogruppi separatamente. Il valore di r2 è risultato inferiore ad una soglia di 0.2 dopo circa 10 kb nel germoplasma completo e dopo 20 kb nella sottopopolazione delle viti selvatiche. Questa discrepanza di valori di LD nelle viti spontanee può essere legata alla ridotta dimensione della popolazione effettiva ovvero alla mancanza di scambio di materiale genetico (gene-flow) tra popolazioni diverse di V. sylvestris.
In seguito, la differenziazione genetica tra le viti coltivate e selvatiche lungo il genoma è stata misurata sottoforma di indice di fissazione (FST) per individuare regioni genomiche con frequenze alleliche divergenti tra le due sottospecie. Il valore medio di FST pari a 0.12 ha suggerito una moderata differenziazione genetica tra le accessioni di sativa e sylvestris, indicando come tra di esse si verifichino frequenti eventi di ibridazione. Tuttavia, circa 2 mila marcatori SNP hanno mostrato un elevato livello di differenziazione tra le viti coltivate e selvatiche (FST > 0.27), come confermato dal test di permutazione. 1,714 geni annotati sono stati identificati in linkage con i suddetti marcatori SNP, mostrando un significativo arricchimento in funzioni geniche predette legate al metabolismo dell’azoto e dei carboidrati, e ai meccanismi di risposta ed adattamento agli stimoli ambientali. Una lieve riduzione della diversità nucleotidica della vite selvatica (πsylvestris/ πsativa ~0.95) è stata osservata nella maggior parte delle suddette regioni geniche con un ruolo nella risposta a stress biotici ed abiotici. Pertanto, una pressione selettiva sta probabilmente operando nelle popolazioni di V. sylvestris per l’adattamento ai sempre più frequenti cambiamenti climatici. Questo risultato sottolinea l’importanza della vite selvatica come putativa fonte di geni e/o alleli di resilienza, i quali potrebbero essere stati persi dalla vite coltivata durante il processo di domesticazione.
L’approccio di genome-wide association study (GWAS) è stato, in seguito, applicato come strategia alternativa per l’identificazione dei geni e delle mutazioni selezionati durante la domestizatione della vite. Pertanto, l’intera collezione di viti coltivate e selvatiche è stata fenotipizzata per il peso della bacca e del grappolo, il numero di grappoli per pianta, la produttività, e la composizione chimica della bacca (contenuto in zuccheri, acidi organici e potassio, acidità titolabile e pH). Un elevata variabilità fenotipica è stata osservata tra e all’interno dei due sottogruppi di vite, soprattutto per i caratteri peso della bacca, pH, contenuto in acidi organici e acidità titolabile. Il test di associazione, corretto per la struttura della popolazione e le relazioni di parentela, ha identificato correlazioni significative marcatore-carattere per tutti i fenotipi studiati, ad eccezione del peso della bacca. Geni codificanti per fattori di trascrizione e per proteine coinvolte nel metabolismo del calcio e delle poliammine sono stati identificati in linkage con i marcatori SNP significativamente associati ai caratteri produttività e peso del grappolo. Inoltre, il test di associazione ha consentito l’identificazione di geni coinvolti nel controllo del pH e dell’acidità totale della bacca, come per esempio i geni codificanti per la subunità A3 della pompa protonica vacuolare ovvero per l’isocitrato liasi.
In conclusione, il presente lavoro di ricerca ha dimostrato per la prima volta come la genetica di popolazione e l’ association mapping siano due validi approcci per individuare le basi genetiche della variabilità fenotipica osservata in un sistema genetico complesso come la vite. Inoltre, sono state fornite evidenze dell’importanza della vite selvatica come modello per lo studio dei meccanismi di adattamento agli stress ambientali. Questi risultati rappresentano la base per comprendere come le viti selvatiche e coltivate reagiscano agli stimoli ambientali, nell’ottica di sviluppare nuovi programmi di miglioramento genetico della vite ed affrontare gli attuali cambiamenti climatici e la crescente richiesta di una viticoltura sostenibile.

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Tipo di EPrint:Tesi di dottorato
Relatore:Valle, Giorgio/GV
Correlatore:Grando, Maria Stella/MS
Dottorato (corsi e scuole):Ciclo 28 > Scuole 28 > BIOSCIENZE E BIOTECNOLOGIE > BIOTECNOLOGIE
Data di deposito della tesi:27 Luglio 2016
Anno di Pubblicazione:27 Luglio 2013
Parole chiave (italiano / inglese):vite/Grapevine, marcatori molecolari/molecular markers, genetica di popolazione/population genetics, mappaggio genico/gene mapping, domesticazione/domestication
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > AGR/07 Genetica agraria
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Biologia
Codice ID:9698
Depositato il:02 Nov 2017 17:29
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