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Russo, Viviana (2016) Synthesis and Evaluation of new prodrug systems of the natural polyphenol Curcumin. [Ph.D. thesis]

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Abstract (english)

The thesis reports the synthesis and characterization of new carbamoylic prodrugs of the natural bioactive polyphenol Curcumin, found in many foodstuff. Curcumin is a promising drug candidate because of its credited beneficial health effects and wide spectrum of action. However, the low bioavailability due to its poor solubility in aqueous media (i.e. physiological fluids) and to its very fast hepatic metabolism, greatly limits the use of Curcumin in the pharmaceutical field.
The “prodrug approach” represents a valid solution to overcome these issues. This is based on the conjugation of the active compound with a specific promoiety through a bioreversible linkage. This modification is expected to improve the pharmacokinetic profile of the compound (prevent fast metabolism and enhance bioavailability). The choice of the bioreversible linker is crucial for the pharmacokinetic performance of the prodrug. I chose and used a urethane linkage, which has been recently demonstrated by our group to be the best option to protect and enhance the bioavailability of natural polyphenols in vivo.
Curcumin was conjugated with two different types of promoieties: natural amino acids and poly-2-alkyl-oxazolines, a class of hydrophilic synthetic polymers.

In particular, leucine, isoleucine and valine were selected as promoieties for the conjugation with Curcumin, since these amino acids show enhanced intestinal absorption due to active transport mechanism. The conjugation of these amino acids with Curcumin could thus improve the absorption of Curcumin following oral administration of the prodrug.
Curcumin has two phenolic hydroxyl groups. I functionalized Curcumin on one and both hydroxy groups by conjugation with amino acids through a urethane linkage, obtaining six new prodrugs (mono- and di-substituted, respectively).
The stability of the new prodrugs and of Curcumin itself in aqueous media was studied using different experimental approaches: UPLC-UV, HPLC/MS, UV-Vis spectroscopy and 1H-NMR. The study of these processes and systems was severely hindered by the solubility of the new Curcumin prodrugs in aqueous media which turned out to be rather poor, either under acidic or near neutral pH conditions, as are found in the stomach and intestine. The prodrugs proved to be more stable in acidic solutions as expected based on the known reactivity of the N-monosubstituted carbamoylic linkage. In solutions at pH 6.8 (as found in the intestine), some degradation was observed. The stability of the new derivatives against hydrolysis was also studied by 1H-NMR spectroscopy in D2O-DMSO-d6 solutions with different D2O contents. No degradation was observed in these aqueous media over three hours.
Preliminary pharmacokinetic experiments were carried out and proved that the di-substituted leucine carbamoyl derivative of Curcumin is capable of improving the bioavailability of the parent phenol in mice model.
Finally, the affinity of these prodrugs for plasma proteins was assed, using fluorescence binding assays with human serum albumin (HSA), which is ubiquitous in the blood stream. All of the new derivatives, except for the mono-leucine prodrug, have higher affinity for HSA than Curcumin itself.
From these combined data a good distribution in the blood stream and high stability against hepatic enzymes can be expected for the new derivatives developed with this thesis, in particular for the mono-functionalized compounds, which make these compounds potential candidates as Curcumin prodrugs.
The last chapter of this thesis is focused on the synthesis of new drug-delivery systems obtained from the self-assembly of amphiphilic polymeric prodrugs of Curcumin. Also in this case a carbamoylic bond was chosen as the linkage between Curcumin and the polymer chain. Poly-2-methyl-2-oxazolines (PMOXAs) were chosen as promoieties for conjugation with Curcumin because of their similarity to the most commonly used poly-ethylene glycols (PEGs), showing the same stealth effects, together with a reduced immune response, and a higher hydrophilicity. In particular, five poly-2-methyl-2-oxazolines of different chain length were conjugated to one hydroxy group of Curcumin. Because of the high hydrophilic character of the PMOXAs, these five new prodrugs can be classified as amphiphiles. Indeed they possess the ability to self-assemble in micelle-like structures when put in aqueous solution, providing good-to-excellent solubility of Curcumin in physiological-like media.
The correlation between the chain length and the self-assembly ability of these prodrugs was investigated. All derivatives have a critical micellar concentration (CMC) in the 10-6-10-4 M range. Curcumin-PMOXA30 showed the highest ability to self assemble into micelles at concentrations as low as 10-6 M. On the contrary, conjugates with PMOXA50 and PMOXA100 resulted in a higher CMC value, probably due to the unfavourable hydrophilic/hydrophobic ratio, typical of longer polymeric chain, which prevents the self-assembly process. On the other hand the derivative Curcumin-PMOXA10, showed the tendency to aggregate and precipitate in solution, probably due to a too pronounced hydrophobic character.

The size and the stability in water of all micelles were tested using dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy (TEM). An inverse correlation between chain length and size was found. In fact, conjugates with PMOXA20 and PMOXA30 form micelles with a diameter around 100-130 nm, whereas analogues with PMOXA50 and PMOXA100 with diameters of about 50-30 nm. For all conjugates, except Curcumin-PMOXA10, a good stability in aqueous environments was observed.
Furthermore, I tested the release of Curcumin from each type of micelles by means of UV-Vis analysis. The experiments were carried out in phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.4 and at 37°C in order to mimic the blood pH value. The conjugate Curcumin-PMOXA30 showed the best kinetic profile with around 90% of released Curcumin during five hours. The other conjugates showed instead a release of Curcumin around 10-30% during the same time.

Abstract (italian)

La tesi descrive la sintesi e la caratterizzazione di nuovi prodrugs carbamoilici della Curcumina ((1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione), un importante polifenolo naturale cui vengono accreditate molteplici proprietà benefiche ed un ampio spettro d’azione. L’utilizzo in campo farmaceutico del composto naturale tal quale è però limitato dalla sua bassa biodisponibilità dovuta a scarsa solubilità nei liquidi fisiologici ed a un rapido metabolismo epatico. Difatti, dopo somministrazione orale di Curcumina, solo tracce del composto naturale vengono ritrovate in circolo. L’approccio prodrug, rappresenta quindi un’utile opzione per aggirare questi problemi. Questo approccio è basato sulla modificazione del composto naturale mediante protezione bioreversibile e coniugazione a specifici sostituenti (promoieties) per ottenere le proprietà chimico-fisiche desiderate (solubilità, stabilità ecc). Sulla base di risultati ottenuti precedentemente con altri fenoli naturali, ho scelto ed utilizzato il legame carbamoilico per coniugare la Curcumina a due diversi tipi di promoieties, amino acidi naturali e polimeri sintetici poliossazolinici.
Nello specifico, tre amminoacidi, leucina, isoleucina e valina, sono stati selezionati come promoieties più promettenti da coniugare alla Curcumina. Gli amminoacidi sono stati scelti per la loro affinità verso specifici trasportatori presenti a livello intestinale. Questo, dovrebbe favorire l’assorbimento intestinale della Curcumina a seguito della somministrazione orale dei prodrugs. Poiché la Curcumina possiede due gruppi idrossilici, ho scelto di funzionalizzarne rispettivamente uno ed entrambi mediante coniugazione con gli amminoacidi. Sono stati sintetizzati così sei prodrugs della Curcumina classificabili in mono- e di-sostituiti.
Successivamente è stata testata la stabilità della Curcumina e dei prodrugs in soluzione acquosa a diversi valori di pH (1 e 6.8) al fine di mimare le condizioni di stomaco e intestino. Sono state effettuate analisi UPLC-UV, HPLC-MS, spettroscopia UV-Vis, e 1H-NMR. Nel condurre questi esperimenti, ho incontrato però numerosi problemi dovuti in particolar modo alla bassa solubilità dei composti in acqua ed alla loro tendenza a precipitare.
I prodrugs hanno mostrato una maggiore stabilità in soluzioni acide, confermando le aspettative relative ai carbammati N-mono-sostituiti, la cui reattività è nota. In soluzioni a pH 6.8 (pH intestinale) sono invece state osservate alcune tracce di degradazione.
L’idrolisi dei derivati è stata studiata anche tramite spettroscopia 1H-NMR usando soluzioni di D2O/DMSO-d6 a diverse percentuali di D2O. Nessuna traccia di degradazione dei prodrugs è stata osservata in queste condizioni.
Gli esperimenti preliminari di farmacocinetica che sono stati condotti su topi modello, hanno inoltre provato che il derivato carbamoilico di-sostituito della Leucina è in grado di aumentare la biodisponibilità della Curcumina dopo somministrazione orale.
Infine, ho verificato l’affinità della Curcumina e dei prodrugs nei confronti delle proteine plasmatiche. In particolare, ho effettuato saggi fluorimetrici di binding utilizzando l’albumina umana (HSA), importante per le sue capacità di complessamento e distribuzione di sostanze farmaceutiche nel sangue. Tutti i sei nuovi prodrugs hanno mostrato un’affinità elevata per l’albumina, superiore a quella della Curcumina stessa, ad eccezione del derivato mono-sostituito della leucina.
Dall’insieme dei risultati ottenuti dallo studio dei prodrugs descritti in questa tesi è emersa la loro buona distribuzione nel circolo sanguigno e un’alta stabilità nei confronti degli enzimi epatici, evidente soprattutto per i composti mono-sostituiti, incoraggiandone così un potenziale utilizzo in campo terapeutico.

L’ultimo capitolo di questa tesi descrive la sintesi di nuovi sistemi di rilascio farmaceutico ottenuti mediante un processo di auto assemblaggio di prodrugs polimerici della Curcumina con caratteristiche anfifiliche. Anche in questo caso è stato scelto il legame carbamoilico per garantire la coniugazione tra i polimeri e la Curcumina. Tra i vari polimeri, la scelta è ricaduta sulle poli-2-metil-2-ossazoline (PMOXAs) la cui somiglianza ai poli-etilenglicoli (PEGs), molto spesso utilizzati in questo campo, sommata ad una minore risposta immunitaria e ad una maggiore idrofilia rende promettente la scelta di questi composti a ruolo di promoieties. In particolare, cinque poli-2-metil-2-ossazoline, differenti tra loro per lunghezza della catena polimerica, sono state coniugate ad un solo gruppo idrossilico della Curcumina.
A causa dell’elevata idrofilicità dei polimeri e della alta idrofobicità della Curcumina, questi nuovi cinque prodrugs possono essere classificati come anfifilici. Essi hanno, infatti, mostrato la capacità di auto assemblare in strutture di tipo micellare in soluzioni acquose garantendo così un’elevata solubilità della Curcumina in condizioni simili a quelle fisiologiche.
Il lavoro si è concentrato in particolare sulla studio della correlazione tra la lunghezza della catena polimerica e la capacità di auto assemblare.
Per tutti i derivati è stata determinata la concentrazione micellare critica (CMC), che si aggira in un intervallo di 10-6-10-4 M. Dai risultati emersi, il coniugato Curcumina-PMOXA30, caratterizzato da una CMC intorno a 10-6 M, si è dimostrato il più incline ad auto assemblare. Al contrario, sono state identificate CMC più alte per i coniugati Curcumina-PMOXA50 e Curcumina-PMOXA100 dovute probabilmente ad un bilancio sfavorevole tra le parti idrofobiche e quelle idrofiliche che, essendo più lunghe, ostacolano il processo di micellizzazione. Dall’altra parte, il derivato Curcumina-PMOXA10 ha mostrato alta tendenza ad aggregare e precipitare a causa della corta catena polimerica che in questo caso non riesce a bilanciare l’idrofobicità della Curcumina.
La stabilità e le dimensioni delle micelle in soluzione acquosa sono state stimate utilizzando il light scattering dinamico (DLS) e la microscopia a trasmissione elettronica (TEM). La lunghezza della catena polimerica e la dimensione delle particelle sono risultate essere in un rapporto di inversa proporzionalità. Infatti, i coniugati costituiti da PMOXA20 e PMOXA30 presentano un diametro intorno a 100-130 nm, mentre i coniugati con PMOXA50 e PMOXA100 mostrano diametri inferiori intorno a 50-30 nm. Inoltre, tutti i coniugati, ad eccezione di Curcumina-PMOXA10, hanno dimostrato una buona stabilità in soluzione acquosa.
Successivamente, ho testato il rilascio di Curcumina da ogni tipologia di micella mediante analisi UV-Vis in soluzione di buffer salino (PBS) a pH 7.4 ed a 37°C per mimare il pH sanguigno. Il coniugato Curcumina-PMOXA30 è risultato il più promettente mostrando il migliore profilo cinetico e favorendo il rilascio di circa il 90 % della Curcumina che costituisce la micella durante le prime cinque ore. Gli altri coniugati hanno invece mostrato profili diversi rilasciando, nello stesso intervallo di tempo, percentuali di Curcumina intorno al 10-30%.


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EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Paradisi, Cristina
Ph.D. course:Ciclo 28 > Scuole 28 > SCIENZE MOLECOLARI > SCIENZE CHIMICHE
Data di deposito della tesi:29 July 2016
Anno di Pubblicazione:29 July 2016
Key Words:Curcumin, prodrugs, polyoxazolines, drug delivery
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 03 - Scienze chimiche > CHIM/06 Chimica organica
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Chimiche
Codice ID:9712
Depositato il:03 Nov 2017 09:43
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