Go to the content. | Move to the navigation | Go to the site search | Go to the menu | Contacts | Accessibility

| Create Account

Faggian, Alessia (2016) Glucotoxicity, Protein Glycation and Adipose Tissue Dysfunction. [Ph.D. thesis]

Full text disponibile come:

[img]PDF Document
Thesis not accessible until 01 November 2019 for intellectual property related reasons.
Visibile to: nobody

23Mb
[img]PDF Document (errata corrige) - Supplemental Material
Thesis not accessible until 01 November 2019 for intellectual property related reasons.
Visibile to: nobody

293Kb

Abstract (english)

Introduction: Glycation is a non-enzymatic reaction between a sugar and a free-amino group contained in molecules such as proteins, amino acids, DNA, RNA, and lipids. In the initial phase, the carbonyl group of the reducing carbohydrate condenses with the free-amino group on the biomolecule to form a reversible glycosylamine, which is then converted to a more stable Amadori product. Once formed, these products can with time undergo to dehydration, cyclization, oxidation, and rearrangements forming a polymorphic group of compounds collectively referred as Advanced Glycation End-products (AGEs). The accumulation of AGEs in vivo is considered the most important link between diabetes and oxidative disease. The rate of glycation could account for the long-term diabetic complications. Nevertheless, the role of AGEs is yet to be determined and it is, still nowadays, an important and challenging field of study. Little is known about their presence and their consequences on adipose tissue; in particular, the role of AGEs on adipogenesis and fat cell functionality remains fully unexplored.
Methods: In this project, 3T3-L1 cell line and stromal vascular fraction cells isolated from human adipose tissue were used. The purpose was to set up an in vitro model for investigating the effects of a chronic exposure to a glycation-inducing environment on the adipogenetic process. Morphological analyses, E.L.I.S.A. assay for AGEs, expression analysis of lipid and glucose metabolism genes, glucose uptake, and immunofluorescence for RAGE, GLP1r, GLUT4 and AGEs, were performed on mature adipocytes. Moreover, the gene expression profile obtained in vitro, was compared to that of subcutaneous and visceral adipose tissues obtained from 64 obese subjects with type 2 diabetes or with normal glucose tolerance underwent to bariatric surgery. In collaboration with the Mass Spectrometry Service (CNR – IENI Padova), the use of mass spectrometry to characterize post-translation modifications induced by glycation was evaluated.
Results and conclusions: Following an exposition to a glycation-inducing environment, an increase of intracellular AGEs both by immunofluorescence and E.L.I.S.A. was observed in our in vitro model. Preliminary analysis on cell cultures suggested that a glycation-inducing environment importantly impacts on gene expression profile. In glycating conditions, an increased expression of Glut4 and, on the contrary, an insulin-induced glucose uptake reduction was observed. These results allow us to hypothesize an influence of AGEs on GLUT4 translocation to the plasma-membrane and/or on its functionality. Finally, although mass spectrometry represents a high potential technique was shown that it has several disadvantages and technical challenges. In particular, several post-translational modifications can affect simultaneously the same protein, thus the total mass increase will reflect the sum of all modifications. Furthermore, spectra analysis of a whole cellular or tissue lysates resulted excessively complex to underline small differences. Multiple steps in which proteins of a specific molecular weight range would be isolated, concentrated and separately assayed are therefore required in order to simplify the analysis by mass spectrometry. 

Abstract (italian)

Introduzione: La glicazione è una reazione non enzimatica tra uno zucchero e un gruppo amminico contenuto in molecole come proteine, aminoacidi, DNA, RNA e lipidi. Nella fase iniziale, il gruppo carbonilico del carboidrato riducente condensa con il gruppo amminico libero delle biomolecole formando una glicosil-ammina reversibile, la quale verrà poi convertita in un prodotto più stabile, detto prodotto di Amadori. Nel tempo, tali prodotti possono subire processi di disidratazione, ciclizzazione, ossidazione e riarrangiamenti formando un gruppo polimorfico di composti indicati come prodotti di glicazione avanzata (AGEs). L'accumulo degli AGEs in vivo è considerato il più importante collegamento tra il diabete e la malattia ossidativa. In particolare, il tasso di glicazione potrebbe spiegare le complicanze diabetiche a lungo termine. Tuttavia, la loro presenza a livello del tessuto adiposo ed il loro ruolo nell’adipogenesi e nella funzionalità dell’adipocita, non sono ancora stati del tutto determinati e sono a tutt’oggi un importante e stimolante campo di ricerca.
Metodi: In questo progetto, sono state utilizzate cellule 3T3-L1 e cellule della frazione vasculo- stromale isolate dal tessuto adiposo umano allo scopo di costruire un modello in vitro per indagare gli effetti indotti sul differenziamento adipogenico dovuti da una esposizione cronica ad un ambiente inducente la glicazione. Sugli adipociti maturi ottenuti in vitro sono stati eseguite: analisi morfologiche, saggi E.L.I.S.A. per gli AGEs, analisi di espressione di geni coinvolti nel metabolismo lipidico e glucidico, misurazione della capacità di captazione del glucosio ed analisi di immunofluorescenza per RAGE, GLP1r, GLUT4 ed AGEs. È stata inoltre confrontata l'espressione genica ottenuta in vitro, con quella misurata nelle biopsie di tessuto adiposo viscerale e sottocutaneo di 64 soggetti obesi con diabete di tipo 2 o con normale tolleranza al glucosio sottoposti ad intervento di chirurgia bariatrica.
In collaborazione con il servizio di Spettrometria di Massa (CNR – IENI, Padova), è stato valutato l'utilizzo della spettrometria per la caratterizzazione delle eventuali modifiche post-traduzionali indotte dalla glicazione.
Risultati e conclusioni: È stato osservato, sia mediante immunofluorescenza, sia mediante test E.L.I.S.A., che un ambiente inducente alla glicazione porta effettivamente ad un aumento degli AGEs intracellulari. Analisi preliminari delle colture cellulari, inducono ad ipotizzare che possano esistere alcuni effetti indotti dall’ambiente glicante sull'espressione genica. In condizioni glicanti, è stata osservata un’aumentata espressione di Glut4 e una ridotta captazione di glucosio che suggerisce una probabile influenza degli AGEs sulla traslocazione e/o sulla funzionalità del trasportatore del glucosio. Tale osservazione suggerisce che possa esistere una probabile influenza degli AGEs sulla traslocazione /o sulla funzionalità del trasportatore del glucosio.
Nonostante la spettrometria di massa sia una metodica molto sensibile ed abbia alte potenzialità, ha anche alcuni svantaggi: modifiche post traduzionali, siano esse enzimatiche o non-enzimatiche, possono essere contemporaneamente presenti sulla stessa proteina; pertanto, l’incremento di massa totale rifletterà la somma di tutte le modifiche. Lo spettro di un lisato intero, si è dimostrato eccessivamente complesso per poter apprezzare piccole differenze. Risulta pertanto necessaria un’analisi composta da più passaggi in cui, in prima istanza verrà isolata e concentrata una frazione di proteine caratterizzate da uno specifico range di peso molecolare che solo in seguito verrà analizzata mediante spettrometria di massa; suddividendo in questo modo l'intero spettro in piccole parti.

Aggiungi a RefWorks
EPrint type:Ph.D. thesis
Tutor:Vettor, Roberto
Ph.D. course:Ciclo 28 > Scuole 28 > SCIENZE MEDICHE, CLINICHE E SPERIMENTALI > METODOLOGIA CLINICA, SCIENZE ENDOCRINOLOGICHE, DIABETOLOGICHE E NEFROLOGICHE
Data di deposito della tesi:31 October 2016
Anno di Pubblicazione:31 October 2016
Key Words:glucotoxicity, protein, glycation, adipose tisse, dysfunction, AGEs, RAGE, mass spectrometry, DPP4, diabetes glycation-inducing-environment, glucotossicità, glicazione, tessuto adiposo, obesità, obesity, GLP1R
Settori scientifico-disciplinari MIUR:Area 06 - Scienze mediche > MED/13 Endocrinologia
Struttura di riferimento:Dipartimenti > Dipartimento di Scienze Cardiologiche, Toraciche e Vascolari
Codice ID:9775
Depositato il:03 Nov 2017 09:32
Simple Metadata
Full Metadata
EndNote Format

Solo per lo Staff dell Archivio: Modifica questo record