Immunogenicity during the treatment of chronic rheumatic diseases: focus on TH9 lymphocytes

Background Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune chronic disease characterized by inflammation of peripheral joints with a various degree of systemic involvement. The pathogenesis is partly understood. Adaptive immunity plays indeed a pivotal role in inducing and maintaining the inflammatory process. Several cells belonging to the adaptive immune system have been associated to specific histological synovial patterns and clinical findings; among these, T helper (Th) lymphocytes have been exhaustively studied in RA due to their capability of producing cytokines and chemokines, migrating into articular sites and activating other immune or resident cells. The pool of Th cells comprehends many subsets, each of which plays a precise role in inducing, tuning and repressing the immune response. Over the past twenty years, five distinct Th cell populations, properly named Th1, Th2, Th17, Th22 and Th9 cells, along with a counterpart of T cells with immune-repressive properties (T regulatory cells) have been described and characterized. Th9 cells develop under stimulation with Tissue Growth Factor-beta (TGF-β) and Interleukin-4 (IL-4) either from naïve or primed Th lymphocytes. They prevalently synthetize IL-9, but, in vitro, the production of IL-10, IL-17, IL-21 and IL-22 has been also reported. Th9 lymphocytes seem to be involved in the immunological responses underlying parasitic infections and allergic diseases. Neutralization of IL-9 worsens the symptomatic course of infestations while ameliorating the allergic manifestations. Some authors have demonstrated that Th9 cells take part to the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, psoriatic arthritis and RA. Th9 lymphocytes are increased in the bloodstream and in the synovial membranes of RA patients, being their percentage directly related to the degree of lymphoid organisation and to the production of autoantibodies, like anti-citrullinated peptide antibodies (ACPAs). However, it is unclear whether Th9 lymphocytes could be involved in the response to the therapy, or in the immunogenicity of biologic agents. Aim Primary objective: to evaluate the prevalence of Th9 lymphocytes in the peripheral blood of RA patients, assigned or not to an immunosuppressant treatment (including conventional drugs and infliximab), and to assess the immunogenicity of infliximab by detecting changes in Th9 percentages following an in vitro stimulation test. Secondary objective: to compare the Th9-related immunogenicity of infliximab originator with that of its biosimilar compound (CT-P13, Remsima®), and to evaluate the influence of demographic and clinical features and concomitant medications on Th9 percentages. Methods We collected peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from 55 consecutive RA outpatients according to ACR/EULAR 2010 criteria and 10 healthy controls. We enrolled 15 subjects affected by RA not treated with immunosuppressive drugs, 20 patients successfully treated with branded infliximab, and 20 patients who discontinued branded infliximab due to adverse events or inefficacy. Allowed drugs included prednisone (< 10 mg/day), methotrexate (< 15 mg/week), sulphasalazine (< 3 g/day), hydroxychloroquine (< 400 mg/day) and, in the group of non responder patients, intravenous (i.v.) abatacept (10 mg/kg every 4 weeks), i.v. tocilizumab (8 mg/kg every 4 weeks), subcutaneous (s.c.) etanercept (50 mg once a week) and s.c. certolizumab pegol (200 mg every other week). The PBMCs were cultured with/without 50 μg/mL infliximab originator (Remicade®) or 50 μg/mL infliximab biosimilar (Remsima®), 50 μg/mL Human IgG1kappa and 50 μg/mL recombinant Human IgG Fc for 18 hours, and the percentage of Th9 cells was assessed by means of flow cytometry. Th9 lymphocytes were firstly identified as IFNγ-, IL-4-, IL-17-, IL-9- secreting CD4+ T cells, and, in a second time, as PU.1+, IRF4+, IL-9+ CD4+ cells. Furthermore, the markers CCR7 and CD45RA were used to distinguish naïve from memory IL-9-producer cells. Results In unstimulated condition, untreated RA patients showed the highest percentages of Th9 lymphocytes, either assessed according to cytokine or transcriptional profile, which was also higher in overall RA patients than in healthy controls. The higher frequency of Th9 cells in RA patients was not associated with higher levels of anti-nuclear autoantibodies or other autoantibody subsets, or with a higher likelihood of experiencing an adverse event or lack of efficacy on infliximab treatment. The percentage of PU.1+, IRF4+ Th9 cells, but not that of IL-9+, IFNγ-, IL-4-, IL- 17- CD4+ cells, increased following the exposure to branded infliximab in the group of non responder RA patients, although these data were not confirmed after biosimilar infliximab exposure. Furthermore, when IL-9 producing T cells were subdivided according to the expression of the markers CD45RA and CCR7, CCR7+, CD45RA- central memory and CCR7-, CD45RA- effector memory IL-9-producer lymphocytes increased in non responder RA patients after branded infliximab exposure, whereas CCR7+, CD45RA+ naïve and CCR7-, CD45+ terminal effector memory Th9 cells, although being more represented in RA patients than in healthy subjects, did not vary after drug stimulation. In line with the previous experiment, the exposure to biosimilar infliximab did not induce an increase in the percentage of memory Th9 cell in non responder patients. Conclusions IL-9 levels are increased in RA patients, in whom this cytokine plays indeed a crucial role. Th9 cells are the major producers of IL-9, and their prevalence is higher in RA patients than in healthy subjects. According to our results, PU.1+, IRF4+ Th9 cells may be involved in orchestrating the immune response against the epitopes of branded infliximab; and this condition could rely on the recall and stimulation of both central and effector memory cells. On the other hand, biosimilar infliximab seems not able to activate these pools of cells. However, no significant difference was noticed in the PU.1+, IRF4+ Th9 cell percentages in Remicade®-responder patients after stimulation test either with biosimilar and branded infliximab, proving that in vitro both the two drugs seem to have a comparable efficacy. Our results carry a novel point of view in the immunogenicity of anti-TNF agents, routinely based on the detection of anti-drug antibodies. However, since actual knowledge is still scarce, these data, highlighting a discrepancy between the Th9- driven immunogenicity of branded and biosimilar infliximab, indeed deserve further investigations.

Introduzione L’artrite reumatoide (AR) è una patologia cronica autoimmune con interessamento delle articolazioni diartrodiali. I meccanismi patogenetici alla base della malattia sono ancora poco chiari. Diverse cellule del sistema immunitario contribuiscono all’innesco e al mantenimento del processo infiammatorio. Tra di esse, i linfociti T helper (Th) svolgono un importante ruolo nella produzione di citochine, chemochine, nel reclutamento di cellule dal torrente circolatorio e nell’attivazione di cellule residenti. Tra i linfociti Th, le cellule Th9, che si sviluppano sotto l’azione combinata del Tissue Growth Factor-beta (TGF-β) e dell’interleuchina 4 (IL-4) a partite da cellule Th naive e Th2, sintetizzano IL-9 e, in minime quantità, IL-10, IL-17, IL-21 e IL-22, e sembrerebbero essere coinvolte nelle risposte immunitarie in corso di infestazioni parassitarie e allergie. Recentemente è stato dimostrato che queste cellule sono anche coinvolte nella patogenesi di patologie autoimmuni, come il lupus eritematoso sistemico, la sclerosi sistemica, l’artrite psoriasica e l’AR. In particolare, in corso di AR, i linfociti Th9 potrebbero dirigere la formazione dei centri linfoidi nel tessuto sinoviale e favorire la produzione di autoanticorpi come gli anticorpi anti-peptide ciclico citrullinato (ACPAs). Non è invece noto il ruolo di tali cellule nella risposta al trattamento con farmaci biologici e nei processi di immunogenicità. Scopo Obiettivo primario: valutare la prevalenza dei linfociti Th9 nel sangue periferico di pazienti con AR, in trattamento o meno con farmaci immunosoppressori (DMARDs convenzionali, steroidi o infliximab) e valutare l’immunogenicità di infliximab relativamente alle risposte Th9 dopo test di stimolazione in vitro, confrontando un gruppo di pazienti con AR responder a infliximab (Remicade®) con un gruppo di pazienti con AR non responder al farmaco. Obiettivo secondario: confrontare, con un test in vitro, l’immunogenicità Th9-correlata di infliximab originator Remicade® con quella del suo biosimilare (CT-P13, Remsima®). Valutare l’influenza delle variabili demografiche, cliniche e farmacologiche sulla variazione delle percentuali linfocitarie Th9. Metodi: Abbiamo arruolato 55 pazienti affetti da AR secondo i criteri ACR/EULAR 2010 e 10 controlli sani. I pazienti con AR erano suddivisi in un gruppo di 15 pazienti naive a terapie immunosoppressive, inclusi gli steroidi; un gruppo di 20 pazienti in trattamento con farmaci convenzionali, steroidi e infliximab (Remicade®) con buona risposta clinica e un gruppo di 20 pazienti che avevano fallito in passato la terapia con Remicade® per eventi avversi o inefficacia e che praticavano altre terapie biologiche (abatacept 10 mg/kg e.v. ogni 4 settimane in 13 casi; tocilizumab 8 mg/kg e.v. ogni 4 settimane in 5 casi; etanercept 50 mg a settimana s.c. in un caso e certolizumab pegol 200 mg ogni 2 settimane s.c. in un caso) oltre a DMARDs e steroidi. Era consentito l’uso di prednisone (< 10 mg/die), methotrexate (< 15 mg/settimana), sulfasalazina (< 3g/die), idrossiclorochina (< 400 mg/die). Dopo firma del consenso informato, le cellule mononucleate ottenute da sangue periferico (PBMCs) di ciascun soggetto sono state poste in coltura con aggiunta o meno di 50 μg/ml di infliximab originator (Remicade®) o 50 μg/ml di infliximab biosimilare (Remsima®), 50 μg/ml di IgG1kappa umane e 50 μg/ml di IgG Fc umane per 18 ore. La percentuale di linfociti Th9 cells è stata valutata per mezzo di indagini citofluorimetriche. I linfociti Th9 sono stati inizialmente identificati come cellule T CD4+ producenti IL-9 ma non esprimenti interferon-gamma (IFNγ), IL-4 e IL-17; e secondariamente come cellule T CD4+ PU.1+, IRF4+ e IL-9+. Sono state valutate inoltre le percentuali dei linfociti Th9 in accordo ai marcatori CCR7 e CD45RA al fine di distinguere le cellule naive dal pool delle cellule di memoria. Risultati Al basale, le percentuali di linfociti Th9, sia valutate in base al profilo citochinico che ai fattori trascrizionali, erano significativamente più alte nel gruppo di pazienti con AR rispetto ai controlli, e tra i pazienti, nel gruppo dei non trattati. Le percentuali di cellule Th9 non erano tuttavia significativamente correlate con lo sviluppo di eventi avversi o inefficacia, né con la comparsa di autoanticorpi non specifici per l’AR (es. anticorpi anti-nucleo). Dopo stimolazione con infliximab originator, la percentuale di linfociti Th9 PU.1+, IRF4+ ma non di quella dei linfociti IL-9+, IFNγ-, IL-4-, IL-17- aumentava significativamente rispetto al basale solo nel gruppo dei non responder. Questo evento non è stato registrato invece dopo stimolazione con infliximab biosimilare. Inoltre, quando i linfociti Th9 sono stati suddivisi in accordo all’espressione delle molecole CD45RA e CCR7, le cellule CCR7+ e CD45RA- (central memory) e quelle CCR7- e CD45RA- (effector memory) aumentavano significativamente rispetto al basale nel gruppo dei non responder dopo stimolazione con infliximab originator ma non biosimilare; al contrario nessuna variazione è stata registrata nelle percentuali dei linfociti CCR7+ e CD45RA+ (naive) nè in quella dei linfociti CCR7- e CD45+ (terminal effector memory). Conclusioni I nostri dati dimostrano che la percentuale di linfociti Th9, che rappresentano i maggiori produttori di IL-9, è maggiore nei pazienti con AR rispetto ai controlli sani. L’IL-9 potrebbe infatti giocare un ruolo fondamentale nel processo patogenetico della malattia. Inoltre, i nostri risultati dimostrano che i linfociti Th9, valutati attraverso i fattori trascrizionali PU.1 e IRF4, potrebbero essere implicati nella risposta immunitaria contro gli epitopi di infliximab originator, attraverso fenomeni di recalling di cellule di memoria. Al contrario, nonostante diversi studi abbiano dimostrato una sostanziale comparabilità dal punto di vista biomolecolare e quindi del profilo di immunogenicità relativo alla produzione di anticorpi anti-farmaco tra infliximab originator e biosimilare, dopo stimolazione in vitro con Remsima® non abbiamo osservato variazioni nelle percentuali delle cellule Th9 rispetto al basale nel gruppo dei non responder. Il nostro lavoro si è incentrato su una diversa prospettiva immunologica nell’ambito dell’immunogenicità di un farmaco biologico anti-TNF, valutando anche la presunta sovrapponibilità del farmaco originator al suo biosimilare. Tuttavia, la conoscenza attuale sull’argomento è ancora scarsa e merita ulteriori ricerche.